藏药二十一味寒水石丸中5个成分的测定

朱林燕, 孔子铭, 谢建锋, 韩泳平

（西南民族大学少数民族药物研究所, 四川 成都 610041）

藏药二十一味寒水石丸中5个成分的测定

朱林燕, 孔子铭, 谢建锋, 韩泳平*

（西南民族大学少数民族药物研究所, 四川 成都 610041）

目的 建立二十一味寒水石丸 （寒水石、 木香、 牛黄、 藏木香等） 中木香烃内酯、 去氢木香内酯、胆酸、 土木香内酯和 异 土木香内 酯 的 RP-HPLC测定方 法。 方 法 二十 一 味寒水石 丸 甲醇提取 液 的测定在迪 马 Diamonsil-2 C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 色谱柱进行， 流动相分别为乙腈-水 （65 ∶35）、 甲醇-0.1%醋酸溶液 （75 ∶25） 和乙腈-0.1%磷酸水 （52 ∶48）; 体积流量分别为 1.0、 0.8、 1.0 mL/min; 柱温均为 30 ℃; 其中木香烃内酯和去氢木香内酯检测使用二极管阵列检测器， 检测波长 225 nm; 胆酸检测使用蒸发光散射检测器， 漂移管温度 90 ℃， 氮气体积流量为 1.6 L/m in; 土木香内酯和异土木香内酯的检测波长为 220 nm。 结果 木香烃内酯、 去氢木香内酯、 胆酸、 土木香内酯和异土木香内酯线性范围分别为 0.043 5 ～0.435 μg（r=0.999 8）、 0.045 ～0.45 μg（r=0.999 9）、 0.506 5 ～2.533 μg（r=0.999 9）、 0.64 ～2.4 μg（r=0.999 3）、 0.64 ～2.4 μg（r=0.999 9）; 平均回收率分别为 99.5%、99.7%、 99.8%、 99.3%、 99.6%;RSD分别为 0.8%、 0.9%、 1.3%、 0.7%、 1.1% （n=9）。 结论 本方法可用于二十一味寒水石丸中5个成分的定量测定。

二十一味寒水石丸; 木香烃内酯; 去氢木香内酯; 胆酸; 土木香内酯; 异土木香内酯;HPLC

二十一味寒水石丸为藏医常用药，用于治疗高原农牧区常见的胃肠道疾病，属于藏医培根木布病范畴［1-2］。它是由 寒水石、渣驯 膏、波棱 瓜 子、 止泻木子、木瓜、紫檀香、石榴子、豆蔻子、牛黄、甘青青兰、绿绒蒿、余甘子肉、唐古特乌头、沙棘膏、荜菝、獐牙菜、藏木香、塞北紫堇、木香、诃子肉等二十一味药材制成的一种复方制剂，具有健脾和胃、理气止痛、活血祛瘀，制酸、止痛，愈溃疡等功效［3］。 临床上用于治疗 “ 培根木布” 引起的各种胃炎、胃溃疡等疾病。方中木香为菊科植物木香 Aucklandia lappa Decne的干燥根茎，多生长在高山草地和灌木丛中。具有理气调中，燥湿化痰等功效［4-5］， 用 于 泻 痢 后 重、 食 积 不 消、 胸 脘 胀 痛、不思饮食，为二十一味寒水石丸中的常用主药，木香烃内酯和去氢木香烃内酯等倍半萜类为其主要活性成分［6-8］， 具有抗炎、 抗菌、 抗 肿瘤等 多方面的生物活性［9-10］。 此 外， 牛黄为常 用 贵 重 药 材［11-12］，具有熄风止痛、清热解毒等功效，胆酸是其主要活性成分之 一［13-14］， 测定 牛 黄 中的 胆 酸 类成 分 是 评价和控制牛黄及其制剂质量的重要指标。而藏木香为菊科植物青木香 Inula racemosa Hook.f的干燥根，具有健脾和胃，调气解郁，止痛安胎作用，用于胸肋、脘腹胀痛，呕吐泻痢，胸肋挫伤，岔气作痛， 胎动不安等症［15］。 经研究表明， 土木香内酯和异土木香内酯是藏木香的主要活性成分，具有显著的抗炎、保肝活性，可抑制感染人型结核杆菌，还能清除活性氧自由基［16］。目前， 二十一味寒水石丸的质量标准中尚无成分定量测定项，为此，本实验选择木香烃内酯、去氢木香内酯、胆酸、土木香内酯和异土木香内酯作为指标成分，采用反相高效液相色谱法进行测定，以控制二十一味寒水石丸的质量。

1 仪器与试药

Waters 2695 型高效液相色谱仪;2996 PDA检测器;ELSD检测器;METTLER TOLEDO AE240电子分析天平 ［梅特勒-托利多仪器 （上海） 有限公司］;KQ-250B型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）; 所用试剂除甲醇、乙腈为色谱纯外，其余为分析纯，水为重蒸馏水。木香烃内酯（ 批 号 1115242200503 ）、 去 氢 木 香 内 酯 （ 批 号11152422005050） 和胆酸 （批号 100078-200414）;土木香内酯 （批号 110760-200507）、 异土木香内酯 （批号 0761200-002） 对照品均购自中国食品药品检定研究院; 二十一味寒水石丸 （由阿坝藏族羌族自治州藏医院提供， 批号分别为 201304、201305、 201306）。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 木香的色谱条件 C18色谱柱 （4.6 mm× 250 mm）; 以乙腈-水 （65 ∶35）为流动相; 检测波长 225 nm; 体积流量 1.0 mL/min; 柱温 30 ℃;进样体积10 μL。

2.1.2 牛黄的色谱条件 C18色谱柱 （4.6 mm× 250 mm）; 以甲醇-0.1%醋酸溶液 （75 ∶25） 为流动相; 体积流量 1.0 mL/min; 柱温 30 ℃; 蒸发光散射检测器参数: 雾化气体 （N2） 体积流量 1.6 L/min; 氮气分压 0.5 MPa; 漂移管温度 90 ℃。

2.1.3 藏木香的色谱条件 C18色谱柱 （4.6 mm ×250 mm）; 以乙腈-0.1 磷酸水 （52 ∶48） 为流动相; 检测波长 220 nm; 体积流量 1.0 m L/min; 柱温 30 ℃; 进样体积 10 μL。

2.2 木香的测定

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取木香烃内酯对照品 8.7 mg、 去氢木香内酯对照品 9.0 mg，置于 100 mL量瓶中， 加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得木香烃内酯和去氢木香内酯的混合对照品溶液 （含木香烃内酯 0.087mg/mL， 去氢木香内酯0.090 mg/mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取本品 1.5 g，置 100 mL具塞锥形瓶中， 用甲醇溶剂 50 mL，密塞，称定质量。 超声提取 30 min， 放冷，称定质量，用溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得测定木香烃内酯和去氢木香内酯溶液。

2.2.3 阴性对照品溶液 根据组方比例， 配制缺木香阴性样品。 按照 “2.2.2” 项方法制备缺木香的阴性溶液。

2.2.4 木香的系统适用性试验 分别取含木香烃内酯和去氢木香内酯的混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各 10 μL， 注入高效液相色谱仪， 按色谱条件进行分析， 木香烃内酯在 11.8 min左右出峰， 去氢木香内酯在 13.2 min 左右出峰，峰型尖锐、对称，结果在与对照品峰保留时间一致的位置上，供试品溶液的木香烃内酯和去氢木香内酯峰峰形良好，理论板数按木香烃内酯、去氢木香内酯计算均不低于 3 000， 木香烃内酯和去氢木香内酯与相邻峰的分离度大于 1.5， 阴性对照无干扰峰。 如图1。

图1 HPLC图谱Fig.1 HPLC chrom atogram s

2.2.5 线性关系考察 精密称取木香烃内酯和去氢木香内酯混合对照品溶液 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、4.0、 5.0 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀， 分别取10 μL注入高效液相色谱仪， 记录色谱图。 以进样量 （μg） 为横坐标 （X）， 峰面积为纵坐标 （Y） 进行线性回归， 得回归方程， 见表1。 结果表明该方法在较大范围内线性关系良好。

表1 线性关系考察Tab.1 Linear correlation

2.2.6 精密度试验 精密取木香烃内酯、 去氢木香内酯混合对照品溶液 10 μL， 分别连续进样 5次，测得木香烃内酯峰、去氢木香内酯峰面积的RSD分别为 0.9%、 0.8%， 结果表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取样品供试液， 室温放置，分别在 0、 4、 8、 10、 12 h 取样 10 μL在高效液相色谱仪上进样，记录色谱图中木香烃内酯、去氢木香内酯面积， 计算其 RSD分 别 为 0.4%、0.4%。 结果表明样品溶液在 12 h 内稳定， 满足测定要求。

2.2.8 重复性试验 取同一批样品 （201304），精密称取5 份， 按 “2.2.2”项下方法制备样品溶液， 分别在高效液相色谱仪上进样 10 μL， 记录峰面积，计算其质量分数。木香烃内酯、去氢木香内酯的 RSD分别为 0.9%、 0.9%。 表明重复性良好。

2.2.9 回收率试验 采用加样回收试验，取已测定的同一批样品 9 份 （批号 201304），按高、 中、低剂量，加上一定量的对照品，按供试品测定项下，进行提取，制备， 测定，计算回收率， 见表2。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

2.3 牛黄中胆酸的测定

2.3.1 胆酸对照品溶液的制备 精密取胆酸对照品 10.13mg置于100 mL量瓶中， 以少量甲醇溶解后稀释至刻度， 摇匀制成含 0.101 3 mg/m L胆酸的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取本品 5.0 g，置 100 m L蒸馏瓶中， 用甲醇溶剂 30 mL， 密塞，称定质量， 超声 30 min， 放冷， 称定质量， 用溶剂补足减失的质量， 摇匀、 过滤， 取续滤液 25 m L，蒸干， 残渣加 20%NaOH 10 mL， 回流 2 h， 冷却，加稀盐酸 19 mL， 调节 pH 3.1 ～3.5 之间， 依次用25、 20、 15 mL乙酸乙酯萃取 3 次， 均用同一铺有少量无水 NaSO4的脱脂棉过滤， 合并滤液， 回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解， 转移至 10 mL量瓶中，稀释至刻度，即得胆酸测定溶液。

2.3.3 阴性对照品溶液 根据组方比例， 配制缺牛黄阴性样品。 按照 “2.3.2” 项方法制备缺牛黄的阴性溶液。

2.3.4 牛黄的系统适用性试验 取胆酸对照品溶液、 供试品溶液及阴性对照溶液各 10 μL， 注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，胆酸在20min 左右出峰， 峰形较为理想， 按胆酸计理论板数不低于4 000; 胆酸与其他杂质峰可达基线分离，分离度大于 1.5; 阴性对照色谱图中， 在胆酸峰位处无阴性干扰。测定结果见图2。

图2 HPLC图谱Fig.2 HPLC chrom atogram s

2.3.5 线性关系考察 精密称取胆酸对照品溶液（0.101 3 mg/mL） 5、10、 15、20、 25 μL， 注入高效液相色谱仪，测得峰面积。以进样体积的自然对数 （X） 为横坐标， 峰面积积分值的自然对数（Y） 为纵坐标进行线性回归， 得回归方程 Y= 1.028 8X+10.034， r=0.999 9， 在 0.506 5 ～2.533 μɡ范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度试验 精密取胆酸对照品溶液10 μL， 分别连续进样 5 次， 测得胆酸峰面积的RSD分别为0.03%， 结果表明精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 取样品供试液， 室温放置，分别在0、 4、 8、 10、 12 h 取样 10 μL在高效液相色谱仪上进样，记录色谱图中胆酸峰面积，计算其RSD分别为 0.1%。 结果表明样品溶液在 12 h 内稳定，满足测定要求。

2.3.8 重复性试验 取同一批样品 （201305），精密称取5 份， 按 “2.3.2” 项下方法制备样品溶液， 分别在高效液相色谱仪上进样 10 μL， 记录峰面积， 计算其质量分数。胆酸的 RSD为 0.02%。表明重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取已测定的同一批样品9 份 （批号 201305）， 按高、 中、 低剂量， 加上一定量的对照品，按供试品测定项下，进行提取，制备，测定， 计算回收率， 具体见表3。

2.4 藏木香的测定

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取土木香内酯对照品、 异土木香内酯对照品 16 mg，置于 100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得土木香内酯和异土木香内酯的混合对照品溶液 （土木香内酯、 异土木香内酯均为 0.16 mg/mL）。

表3 加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests for cholic acid

2.4.2 供试品溶液的制备 精密称取本品 2.0 g，置 100 mL具塞锥形瓶中， 用甲醇溶剂 50 mL，密塞， 称定质量。 超声提取 30 min， 放冷， 称定质量，用溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得土木香内酯、异土木香内酯测定溶液。

2.4.3 阴性对照品溶液 根据组方比例， 配制缺藏木香阴性样品。按照 “2.4.2”项方法制备缺藏木香的阴性溶液。

2.4.4 藏木香的系统适用性试验 分别取含土木香内酯和异土木香内酯的混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各 10 μL， 注入高效液相色谱仪， 按色谱条件进行分析， 土木香内酯在 32.8 min左右出峰，异土木香内酯在 35.3 min 左右出峰，峰形尖锐、对称，理论板数按土木香内酯、异土木香内酯计算均不低于 3 000， 土木香内酯和异土木香内酯与相邻峰的分离度大于 1.5，阴性对照无干扰峰。 具体见图3。

图3 HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms

2.4.5 线性关系考察 精密称取土木香和异土木香内酯混合对照品溶液 4、6、 8、 10、 15 mL置于10 mL量瓶中， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀， 分别取10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。 以进样量 （μg） 为横坐标 （X）， 峰面积为纵坐标 （Y）进行线性回归， 得回归方程， 见表4。 结果表明该方法在较大范围内线性关系良好。

表4 线性关系考察Tab.4 L inear correlation

2.4.6 精密度试验 精密取土木香内酯、 异土木香内酯的对照品溶液 10 μL， 分别连续进样 5 次，测得土木香内酯、 异土木香内酯峰面积的 RSD分别为 0.7%、 0.3%， 结果表明精密度良好。

2.4.7 稳定性试验 取样品供试液， 室温放置，分别在 0、 4、 8、 10、 12 h 取样 10 μL在高效液相色谱仪上进样，记录色谱图中土木香内酯和异土木香内酯峰面积，计算其 RSD分别为 0.1%、0.4%。 结果表明样品溶液在 12 h 内稳定， 满足测定要求。

2.4.8 重复性试验 取同一批样品 （201306），精密称取5 份， 按 “2.4.2” 项下方法制备样品溶液， 分别在高效液相色谱仪上进样 10 μL， 记录峰面积，计算其质量分数。土木香内酯和异土木香内酯的 RSD分别为 0.6%、0.2%。表明重复性良好。2.4.9 回收率试验 采用加样回收试验， 取已测定的同一批样品 9 份 （批号 201306）， 按高、 中、低剂量，加上一定量的对照品，按供试品测定项下，进行提取，制备，测定，计算回收率。结果见表5。

表5 加样回收率试验结果Tab.5 Results of recovery tests

2.5 样品测定 取 3 批样品， 按 “2.2” 项下方法测定峰面积，每份平行测定3次，根据标准曲线法计算木香烃内酯、去氢木香内酯、胆酸、土木香内酯和异土木香内酯的量， 结果见表6。

3 讨论

3.1 提取溶剂和提取方法的选择 分别考察了甲醇、乙醇和乙酸乙酯等溶剂的提取效果，结果表明甲醇提取率最高，效果最好;同时对提取方法（回流和超声） 及提取时间等因素进行了考察，结果表明在超声提取 30 min 的条件下提取率较为稳定，为最佳实验条件。

表 6 样品测定结果 （n=3）Tab.6 Determ ination result of sam p les（ n=3）

3.2 流动相的选择 在胆酸的测定中，分别尝试了甲醇-0.1%醋酸水溶液为 75 ∶25、 80 ∶20、 85 ∶15 等不同比 例［17-18］， 随甲醇用量 升 高 保 留 时 间 逐渐变短，但是峰与峰之间分离度越差，最终选择了75 ∶25 这个洗脱体系。 当体积流量为 1.0 mL/min时， 柱压大于 3 000 psi（1 psi=6.895 kPa）， 所以体积流量控制在 0.8 m L/min 为宜。

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Determ ination of five constituents in Ershiyiwei Hanshuishi Pills

ZHU Lin-yan， KONG Zi-ming， XIE Jian-feng， HAN Yong-ping*

（ Ethnic Pharmaceutical Instituteof Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

AIM To establish the method for determining costunolide， dehydrocostus lactone，cholic acid，alantolacton， and isoalantolactone in Ershiyiwei Hanshuishi Pills（ Hanshuishi， Aucklandia lappa Decne.， Bostaurus domesticus Gmelin， I nula racemosa Hook.J， etc）.METHODS The sampleswere separated on Diamonsil-2 C18column （4.6mm×250 mm， 5 μm） using acetonitrile-water（65 ∶35）， methanol-0.1%acetic acid （75 ∶25） and acetonitrile-0.1%phosphoric acid （ 52 ∶48 ） asmobile phase with the flow rate of 1.0 mL/min， 0.8 mL/min and 1.0 mL/min， respectively.The column temperature was kept at30 ℃.2996PDA detector was used for costunolide and dehydrocostus lactone.The detection wavelength was 225 nm and ELSD was used for cholic acid.The flow rate of nitrogen was 1.6 L/min and the temperature of drift tube was 90 ℃.The detection wavelength was 220 nm for lantolactone and isoalantolactone.RESULTS The linear ranges for costunolide， dehydrocostus， cholic acid， alantolactone and isoalantolactone were 0.043 5-0.435 μg（r=0.999 8）， 0.045-0.45 μg（r=0.999 9）， 0.506 5-2.533 μg（r=0.999 9）， 0.64-2.4 μg（r=0.999 3） and 0.64-2.4 μg（r= 0.999 9）， respectively.The average recovery rateswere 99.5%， 99.7%，99.8%，99.3%and 99.6%， respectively.The RSD were0.8%，0.9%， 1.3%，0.7%and 1.1%，respectively.CONCLUSION Thismethod is suitable for the quantitative determination of Ershiyiwei Hanshuishi Pills.

Ershiyiwei Hanshuishi Pills;costunolide;dehydrocostus lactone;cholic acid;alantolactone; isoalantolacton;HPLC

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2526-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.018

2014-04-21

国家十二五科技支撑计划 （2012BAI27B07）; 西南民族大学硕士点建设项目 （2014XWD-S0703）

朱林燕 （1990—）， 女， 硕士生， 主要从事天然药物的化学与质量研究。

*通信作者: 韩泳平， 教授， 硕士生导师。 Tel: （028） 85522315， E-mail:yphan65@tom.com