微生物吸光值法定量检测实验

陈杰+++张振远

摘 要：通过对铀矿冶生物技术国防重点学科实验室提供的巴氏芽孢杆菌的培养，分别取相同菌量1ml菌悬液（OD600=1.0440），按相应体积倍数稀释后，测定各OD600值。数据的拟合发现，全部稀释倍数乘幂关系拟合线拟合度不高，OD600值大于1或小于0.2时，越靠近坐标轴，数据越失真，误差越大。截取0.2～1.0之间的OD600值，拟合乘幂曲线为y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976），应用简单倍数关系y=1.044/x换算，两者误差都维持在5%之内。OD600值在0.2～1.0之间运用简单倍数关系换算准确、快捷。

关键词：菌量；快捷；最优区间；倍数关系

1 引言

微生物在人类生产生活中体现的特殊优势早已出现，如污水治理中重金属离子的细菌吸附[1]、矿业工程的生物浸出[2]、岩土工程的生物固化[3-4]等等，微生物已成为国内外研究的热点。

在研究微生物的过程中，对微生物量的测定是必须的一个过程。测定微生物生长的方法很多，可分为直接法和间接法两大类。直接法有粗放的测体积法（在刻度离心管中测沉降值）和精确的称干重法。间接法有比浊法和生理指标法[5]。比浊法是实验室中经常使用的一种方法，用分光光度计选定一定波长（450nm～650nm），对微生物悬浮液进行吸光度的测定[6]。比浊法适用范围广，测量值在一定的区间内比较准确、可靠[7]。

采用比浊法测定的OD值，与细菌的浓度在一定范围内是呈现着正比例的关系[8]。实验室中经常会遇到菌悬液稀释的问题，稀释后的菌悬液OD值和初始的悬液OD值的关系却也不是简单的倍数关系，而是呈现出一种乘幂关系[9]。较高的初始OD值需要稀释且较低的OD值需浓缩后才能用于测定，而不能直接测定以防止检测结果的不准确性，出现较大的误差甚至是错误[10]。

为此，准确测定细菌菌液浓度，了解在一定OD值范围内，稀释倍数与稀释OD值的关系及准确快速进行菌量比较的方法在对实验数据的相关换算方面有着一定的意义。

2 材料和方法

2.1 仪器设备

AL 104电子天平、VB-40高压灭菌锅（德国systec）、SW-CJ-1FD洁净工作台、小容量恒温高速培养振荡器摇床（SHP-200D）、微量冷冻离心机（5415R Germany）、蛋白核酸测定仪（biophotometer eppendorf Germany）、pHS-3C酸度计、eppendorf移液枪

2.2 菌种

保存在超低温冰箱的巴氏芽孢杆菌单一菌株，菌种由铀矿冶生物技术国防重点学科实验室提供。

2.3 细菌培养

培养基成分为酵母提取物20g/L、氯化铵10g/L及去离子水，pH调至8.5，过滤灭菌器经高压灭菌锅灭菌后，放置洁净工作台对培养基进行过滤灭菌。每100ml培养液放置在250ml锥形瓶中，母液（OD600值1.500）1：100接种，放置摇床中，温度30℃，转速200r/min。

2.4 细菌悬液制备

放置摇床8h后，取出菌液。取30支2ml的离心管，1000μL移液枪准确移取菌液，每离心管1ml。30支离心管分A、B两批，每批15支，分别放置于离心机中，转速10000rpm，温度4℃，离心10分钟，离心后吸除上清液，用2ml生理盐水冲洗细菌，再次离心。重复冲洗离心一次。分别将离心之后的细菌用生理盐水稀释成0.3ml、0.4ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml。

2.5 OD600值的测定

以生理盐水为空白样，用蛋白核酸测定仪测定各样品OD600值。

3 实验结果与讨论

实验记录数据如表1。

截取OD600值0.2～1的数据，乘幂关系拟合图为图2。

图1对于全部稀释倍数（0.3～12.5），用乘幂关系拟合后，拟合程度不高（R2=0.9258<0.95），在0

图2截取OD600值0.2～1的数据，乘幂关系拟合，R2=0.9976。原始数据带入拟合公式y=1.0764x-1.0115（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数），分别得出y1～y5及所对应的误差δ1～δ5（如表2）。最大误差为δ4.5=4.10%，最小误差为δ3=0.56%，对实验数据的换算具有较高的准确性，且能达到99.44%。

实际的菌液稀释换算中简单的倍数关系更加的快捷易于把握，用公式y=1.044x-1（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数）换算，分别得出y'1～y'5及所对应的误差δ'1～δ'5（如表2）。最大误差为δ'1.5=5.33%，最小误差为δ'4=0.80%，在0.2

两次换算结果数据如表2。

从表2中对比得出：OD600值在1～0.2区间上，两种换算关系结果的误差维持在5%的水平，具有较高的精确度，而超过这一范围即OD600值在大于1或者小于0.2时，越靠近坐标轴任意两种换算的结果误差就越大，失去了换算的指导意义。菌悬液稀释曲线呈现的是乘幂关系和徐风[9]等人的结论一致。简单的倍数关系曲线更易于换算和把握，与陶海静[11]的结论相似。实际应用过程中，在特定的范围内（OD600值在1～0.2之间），将高浓度的菌悬液稀释到此区间，用简单的倍数换算就可以得到较为精确的换算值，方便于不同菌悬液菌量的比较。

4 结论

（1）菌悬液稀释倍数与稀释OD600值不是呈现出简单的倍数关系，而是区间性的乘幂关系或是区间性的简单倍数关系。

（2）此菌悬液稀释值处在0.2～1.0之间，液稀释倍数与稀释OD600值的乘幂关系公式为y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数），同样在此区间内满足简单倍数关系y = 1.044/x（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数）。

（3）实验室中测定菌悬液OD600值应处在0.2～1.0之间，应用简单的倍数关系换算，准确度达到95%，提高了实验数据的准确性及比较换算的快捷性。

参考文献

[1]Mohamed，ZA，El-Sharouny，HM，Ali，WS et al. Microcystin concentrations in the Nile River sediments and removal of microcystin-LR by sediments during batch experiments[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2007，04：489-495.

[2]DELVASTO P， VALVERDE A， BALLESTER A. Diversity and activity of phosphate bioleaching bacteria from a high-phosphorus iron ore[J].hydromet，2008，92：124-129.

[3]Hamed A. Keykha， Bujang B.K.Huat， Afshin Asadi. Electro-Biogrouting and Its Challenges[J].International Journal of Electrochemical Science，2012，7：1196-1204.

[4]A.AL QABANY，K.SOGA.Effect of chemical treatment used in MICP on engineering properties of cemented soils[J].Geotechnique，2013，04：331-339.

[5]罗映辉，邬国军，余俊龙，夏忠弟，文质.细菌繁殖与计数新方法的实验研究[J].实用预防医学，2003，05：828-829.

[6]李绍戊，杨洪波，王荻等.用紫外分光光度法测定嗜水气单胞菌的浓度[J].水产学杂志，2013，02：40-42.

[7]莫继先，王志刚，王昌河.常见微生物数量测定方法比较[J].生物学教学，2012，01：42-43.

[8]李冬阳，茹柿平，吴坚等.分光光度法快速检测细菌[J].分析化学，2010，04：573-576.

[9]徐凤，雷萍.菌悬液稀释倍数与OD_（600）的关系实验[J].环保科技，2010，03：43-45.

[10]唐翠明，王振江，邝哲师，等.桑树青枯病菌紫外分光度计菌方法的研究[J].广东蚕业，2008，03：42-44.

[11]陶海静.鸡大肠杆菌计数方法研究[J]. 安徽农业科学，2007， 27：8504-8504+8516.

*作者简介：陈杰（1989，10-），男，湖南华容人，南华大学核资源工程学院采矿工程硕士研究生，研究方向为微生物岩土工程。endprint

（2）此菌悬液稀释值处在0.2～1.0之间，液稀释倍数与稀释OD600值的乘幂关系公式为y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数），同样在此区间内满足简单倍数关系y = 1.044/x（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数）。

（3）实验室中测定菌悬液OD600值应处在0.2～1.0之间，应用简单的倍数关系换算，准确度达到95%，提高了实验数据的准确性及比较换算的快捷性。

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*作者简介：陈杰（1989，10-），男，湖南华容人，南华大学核资源工程学院采矿工程硕士研究生，研究方向为微生物岩土工程。endprint

（2）此菌悬液稀释值处在0.2～1.0之间，液稀释倍数与稀释OD600值的乘幂关系公式为y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数），同样在此区间内满足简单倍数关系y = 1.044/x（y为稀释后菌液的OD600值，x为稀释倍数）。

（3）实验室中测定菌悬液OD600值应处在0.2～1.0之间，应用简单的倍数关系换算，准确度达到95%，提高了实验数据的准确性及比较换算的快捷性。

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[9]徐凤，雷萍.菌悬液稀释倍数与OD_（600）的关系实验[J].环保科技，2010，03：43-45.

[10]唐翠明，王振江，邝哲师，等.桑树青枯病菌紫外分光度计菌方法的研究[J].广东蚕业，2008，03：42-44.

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*作者简介：陈杰（1989，10-），男，湖南华容人，南华大学核资源工程学院采矿工程硕士研究生，研究方向为微生物岩土工程。endprint