丝状真菌中纤维素酶与半纤维素酶的合成调控

王方忠，蒋 艺，刘奎美，姜宝杰，王明钰，2，方 诩，2

(1.山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 250100;2.山东大学 国家糖工程技术研究中心，济南 250100)

当今世界经济的飞速发展很大程度上依赖石油资源的大量开采和利用。随着石油、煤炭等矿石资源渐进枯竭，寻找可替代的液体燃料来维持人类社会可持续发展迫在眉睫。木质纤维素资源在自然界中含量丰富并在转化液体燃料方面具有很好的潜在应用价值［1］。自然界中降解木质纤维素资源的策略很多，如在腐烂的树枝枯叶中生存的丝状真菌，在转化木质纤维素方面发挥重要作用。研究较为深入的丝状真菌有红褐肉座菌［2］(Hypocrea jecorina)、粗糙脉孢菌［3］(Neurospora crassa)和草酸青霉［1］(Penicillium oxalicum)等。

虽然丝状真菌能够分泌大量纤维素酶和半纤维素酶类，但是其产量还不足以支持工业化规模转化木质纤维素类底物。因此，有必要解析丝状真菌合成纤维素酶和半纤维素酶的调控网络，从而为制定相关策略以提高工业菌株生产纤维素酶和半纤维素酶产量提供理论参考。研究人员发现了很多参与调控纤维素酶和半纤维素酶表达的调控因子及其调控机制［4］。例如，碳代谢阻遏及转录因子Cre1，丝状真菌中现已发现参与碳代谢阻遏的同源蛋白Cre1［2］。在里氏木霉和曲霉中Cre1可调控许多纤维素和半纤维素酶基因表达。在Cre1突变菌株中，在葡萄糖存在条件下丝状真菌仍能够大量表达纤维素酶和半纤维素酶基因。Ace1和Ace2都是通过酵母双杂交分离出来的转录调控因子［4］。Ace1是一个含有3个Cys(2)-His(2)类锌指结构的DNA结合蛋白，在里氏木霉中敲除基因ace1后，在纤维素和槐糖的培养条件下能够提高主要的纤维素酶基因和半纤维素酶基因表达量，这表明ace1为转录抑制因子;里氏木霉中敲除基因ace2后，在纤维素培养条件下主要的纤维素酶基因和半纤维素酶基因表达量减少，这表明ace2为转录激活因子。Xyr1是双核锌指类转录激活因子，在里氏木霉中Xyr1的调控不受诱导物和纤维素酶基因本身表达模式影响，而是纤维素酶与半纤维素酶基因转录所必需的［2］。

最近几年，调控丝状真菌合成纤维素酶和半纤维素酶的研究集中以下方面:胞外信号分子(C源，光信号)的调控;对以上发现的转录因子的最新研究和一些新的转录调控因子发现;染色质重建调控等。笔者对近年来丝状真菌调控纤维素酶和半纤维素酶合成机制进行综述，希望为相关研究工作提供参考。

1 丝状真菌合成纤维素酶和半纤维素酶的信号感应机制

在自然界中，有很多信号分子能够调控丝状真菌合成纤维素酶和半纤维素酶，其中研究较多的有碳信号和光信号。

1.1 碳信号

碳信号研究主要集中在寻找菌体内部真正的诱导物，乳糖诱导里氏木霉表达纤维素酶机制及碳信号识别受体等方面工作。

一般认为，纤维素首先被丝状真菌分泌的少量纤维素酶水解成葡萄糖和纤维寡糖，一部分纤维寡糖再被水解成葡萄糖供菌体利用，一部分则诱导纤维素酶表达。但是，不清楚在菌体内部起诱导纤维素酶表达的具体是哪种纤维寡糖。敲除粗糙脉孢菌胞外3个主要的β-葡萄糖苷酶基因后，菌体不能够将纤维二糖转化成葡萄糖，但是仍可在纤维二糖培养条件下有效的诱导纤维素酶表达［4］。草酸青霉114-2中敲除胞外 β-葡萄糖苷酶基因 bgl1和胞内主要β-葡萄糖苷酶基因 bgl2后，发现纤维二糖(而不是其转糖基产物槐糖和龙胆二糖)能直接诱导菌株表达纤维素酶和半纤维素酶［5］。相似的结果也在里氏木霉中有所报道［6］。敲除里氏木霉胞内外主要的β-葡萄糖苷酶基因的菌株，纤维素酶基因的表达在纤维素培养条件下出现延迟，但在纤维二糖培养条件下并不受影响，同时向纤维素培养基中添加纤维二糖能够恢复敲除株表达纤维素酶能力［6］。在纤维素培养基中，里氏木霉水解纤维素释放的纤维二糖的浓度利于菌体吸收而不是被β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖［7］。在里氏木霉中，发现1个对纤维二糖有催化活性的葡萄糖-核糖醇脱氢酶(GRD1)，GRD1能够正调控纤维素酶基因表达［8］。这些实验结果都暗示着纤维二糖或其代谢产物(而不是其转糖基产物)是自然界中丝状真菌菌体内部诱导纤维素酶表达的真正诱导物。值得注意的是，所有的敲除β-葡萄糖苷酶基因的实验都没有提供直接的证据来证明菌体是不能将纤维二糖转化成其转糖基产物(如槐糖)，但是，里氏木霉野生菌株的细胞破碎液是能够将纤维二糖转化成槐糖的［9］。所以，丝状真菌菌体内部纤维素酶真正的诱导物是什么仍然没有很明确的结论。在里氏木霉中，低浓度D-木糖和L-阿拉伯糖能够诱导木聚糖酶大量的表达，但高浓度时却会抑制木聚糖酶的相关表达。Mach-Aigner等［10］通过敲除里氏木霉木糖代谢路径第一个关键酶(木糖还原酶)，发现起诱导作用的应该不是 D-木糖，而可能是 D-木糖的代谢产物。然后，通过阻断里氏木霉D-木糖代谢路径检测木聚糖酶表达水平，发现D-木糖中间代谢物L-阿拉伯糖醇才是真正的诱导物［10］。但是这种观点并不被Seiboth等［7］接受，他们认为 Mach-Aigner等人测试木聚糖转录的时间点太早，此时D-木糖的诱导仍然还不明显，并且敲除木酮糖还原酶基因后，向培养基中添加木糖仍然有木聚糖酶表达。Seiboth 等［7］认为，D-木糖本身起诱导作用而非 L-阿拉伯糖，因此可能是L-阿拉伯糖醇诱导木聚糖酶表达。

乳糖并不是纤维素降解产物或其衍生物，但是能够显著诱导里氏木霉表达纤维素酶［7］。乳糖诱导纤维素酶表达依赖生长速率，即在低生长速率条件下有较高的纤维素酶产生。

乳糖及水解产物D-半乳糖都能诱导纤维素酶基因表达。在相同生长速率条件下，乳糖的诱导效果明显强于半乳糖。由于胞内缺少来源GH2家族β-半乳糖苷酶(BGA1)的活性，所以，以前认为乳糖只可能被胞外或结合在细胞壁上的β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和β-D-半乳糖，β-D-半乳糖再参与到纤维酶的诱导中。但是Ivanova等［11］研究发现在里氏木霉中有1个乳糖转运蛋白，将其基因敲除后导致里氏木霉菌株不能在乳糖培养基中生长也不能吸收乳糖，同时不能表达纤维素酶，但纤维素酶基因仍受槐糖诱导。这使得乳糖诱导机制变得十分复杂。造成以上现象的原因，一种可能的情况是乳糖被胞外BGA1水解成葡萄糖和β-D-半乳糖，且β-D-半乳糖参与纤维素酶诱导;另一种情况可能是乳糖本身作为信号分子。这又可能出现2种情况:①发现的乳糖转运蛋白直接作为乳糖特异识别受体参与诱导纤维素酶基因的表达;②乳糖转运蛋白将乳糖转运到胞内，被胞内有类似BGA1水解活性的酶类水解后，β-D-半乳糖参与纤维素酶诱导。代谢半乳糖有2条途径:①还原路径;②Leloir路径［7，12］，但 Leloir路径只能代谢 α-D-半乳糖。而β-D-半乳糖和 α-D-半乳糖转换又依以下2种方式:①pH依赖的构型变化;②半乳糖变旋酶催化。虽然里氏木霉有3个半乳糖变旋酶，但是在其胞内外并不能检测到有半乳糖变旋酶活性。在里氏木霉中，表达来源于酵母的gal10基因C-末端具有半乳糖变旋酶的结构域，可以使 β-D-半乳糖大量转化成α-D-半乳糖，虽然菌体在纤维素培养基中生长不受影响，但是在乳糖培养条件下纤维素酶基因转录明显减少，这寓示着，缺少相应半乳糖变旋酶活性，是里氏木霉在乳糖培养基上诱导表达纤维素酶的重要因素并且β-D-半乳糖在乳糖诱导过程发挥重要作用［12］。

寻找识别碳信号的受体仍然是非常重要的工作，根据现在实验证据推测碳信号识别受体可能存在2种情况:①位于膜上寡糖转运蛋白或同源物;②相关代谢酶类或同源物。在里氏木霉中发现1个寡糖转运蛋白Crt1，将其基因敲除后并不影响里氏木霉转运纤维二糖和槐糖。分别在纤维素、乳糖和槐糖培养条件下，Δcrt1菌株并不能表达纤维素酶，同时其生长受到严重抑制。这就说明Crt1可能是一个关键的独立于胞内糖信号传递的碳信号受体［13］。还有一个实验结果需引起注意，在里氏木霉中敲除胞内主要的β-葡萄糖苷酶基因后，在纤维素培养条件下菌株的纤维素酶基因表达受到明显抑制［6］。这就说明β-葡萄糖苷酶不可能仅仅发挥着水解作用，β-葡萄糖苷酶也可能是碳信号的一个识别受体。乳糖信号识别受体除了可能是前面提到的乳糖转运蛋白外，还可能存在其他受体蛋白。在里氏木霉中，敲除乳糖代谢Leloir路径第一个酶半乳糖激酶基因gal1，会导致在乳糖培养基上纤维素酶表达量明显减少，但是敲除随后路径中相关酶类基因，纤维素酶类表达并没有受到影响。如果同时敲除Leloir路径第一个酶半乳糖激酶基因和还原路径的第一个酶木糖还原酶基因，纤维素酶表达水平和单敲除半乳糖激酶基因的水平基本一致，说明单敲除株和双敲除株破坏的靶向物是一致的［14］。因此，可以猜测半乳糖激酶基因gal1是乳糖诱导纤维素酶表达的一个关键信号受体蛋白。

寡糖转运蛋白是否是碳信号识别受体还需要进一步深入研究。但至少有许多寡糖转运蛋白通过转运活性影响纤维素酶表达的报道。例如，粗糙脉孢菌中发现的CDT-1和CDT-2［15］，里氏木霉中发现的 Stp1［13］。

1.2 光信号

光调控丝状真菌表达纤维素酶是依赖于C源诱导物存在。

在里氏木霉中，以纤维素为C源只能够增强纤维素酶表达［16］，但以乳糖为C源时，光却能够抑制纤维素酶表达［17］。BLR1和BLR2是里氏木霉中蓝光受体蛋白。在光照条件下，BLR1和BLR2对纤维素酶基因转录起正调控作用。在黑暗条件下，虽然BLR1和BLR2对纤维素酶基因转录也起正调控作用，但是敲除基因blr1导致菌体分泌纤维素酶能力增强，敲除blr2后导致菌体分泌纤维素酶能力变弱，这说明BLR1和BLR2的功能相互独立，并不形成复合物［18-19］。在里氏木霉中，破坏光调节蛋白ENVOY(env1)的PAS结构域后，在光照条件下，纤维素酶诱导作用发生延迟，在黑暗条件下诱导不能持续［16］。进一步分析 Δblr1、Δblr2和 Δenv1发现，无论在光照还是黑暗条件下，cbh1基因转录情况在3个敲除株中保持一致，同时在Δblr1和Δblr2敲除株中并不能检测到env1基因转录。这暗示着blr1和blr2位于env1上游［18］。G蛋白参与的信号途径影响很多重要的生理过程，G蛋白有GNA、GNB和GNG这3个亚基组成。在里氏木霉中，虽然3个亚基对纤维素酶表达都有调控作用［20］，但是只有GNA(GNA3和GNA1)参与了依赖诱导物的光调控丝状真菌表达纤维素酶。在光照和纤维素培养条件下，沉默基因gna3会导致依赖光的纤维素酶延迟表达，敲除基因gna1后，在光照下纤维素对纤维素酶的诱导作用丧失，但黑暗下诱导作用反而增强;而组成型激活基因gna3和gna1都表现出依赖光和诱导物，随着光强和诱导物的增加，纤维素酶基因的表达量亦增加。GNA1能抑制基因env1表达，ENVOY则抑制基因gna3表达。ENVOY能够正向调控gna1自我反馈激活，但不能调控 gna3［21-23］。在组成型激活gna3和gna1菌株中，分别敲除基因env1后，在黑暗条件下，敲除株与出发株在菌丝形态，生孢能力及纤维素酶转录方面表现一致;在光照条件下，表现出与单敲除env1一致的表型。这些结果说明ENVOY可能通过影响与gna3和gna1之间相互调控耦联光信号和G蛋白信号通路，进而影响纤维素酶表达，但在黑暗条件下ENVOY不影响G 蛋白信号通路［23］。

细胞内cAMP的浓度能影响纤维素酶表达，并且受到光信号调控［23］。外源添加cAMP会影响丝状真菌分泌纤维素酶［24］。胞内cAMP浓度受到产生cAMP的腺苷酸环化酶(ACY1)和降解cAMP的磷酸二酯酶调控，cAMP通过激活蛋白激酶 K(PKA)调控下游靶基因，进而影响相关生理过程。在里氏木霉中，敲除env1会造成胞内cAMP减少，但向敲除株中添加cAMP则会导致敲除株出现更严重的缺陷表型，同时，敲除株中基因acy1表达量并没有减少。但是，添加磷酸二酯酶抑制剂，敲除株表型缺陷能逐渐恢复。这些结果说明了ENVOY能抑制磷酸二酯酶，但不影响腺苷酸环化酶。敲除cAMP路径上2个主要组分——腺苷酸环化酶(ACY1)和cAMP依赖的蛋白激酶K(PKA)的催化结构域，发现基因acy1在光照、黑暗下均正调控纤维素酶表达，而基因pka仅在光照下有正调控作用，黑暗下则表现出负调控作用。PKA可能通过调控结合在纤维素酶或相关转录因子的启动子上的蛋白复合物来影响纤维素酶表达［17］。综上可以看出:在里氏木霉中，ENVOY既能耦联G蛋白信号通路，又能影响cAMP信号路径，是光信号调控的关键基因。

相类似工作在粗糙脉孢菌中也有开展［25］。WC-1、WC-2和VVD都为含有PAS结构域的光受体蛋白。在里氏木霉中，WC-1和WC-2的对应同源蛋白分别为BLR1和BLR2。在光照条件下，它们对大多数纤维素酶和半纤维素酶起正调控作用，VVD只对少数纤维素酶基因起负调控作用。

2 转录水平调控纤维素酶和半纤维素酶基因的表达

2.1 转录因子调控纤维素酶和半纤维素酶基因表达

很多蛋白能够结合到纤维素酶和半纤维素酶基因的启动子区，激活或者抑制相关基因表达。Xyr1、Ace2、Hap2/3/5、Ace1和Cre1是较早发现的能够调控纤维素酶表达的转录因子［3］。在里氏木霉中，Xyr1的体外结合序列为5'-GGC(T/A)4-3'［26］。Xyr1受到乳糖和半乳糖的诱导，但半乳糖代谢产物并不能影响基因xyr1表达。同时，Xyr1能激活木糖还原酶1(Xyl1)和β-半乳糖苷酶1(Bga1)从而调控乳糖和半乳糖代谢路径［27-28］。Cre1和Ace1抑制基因xyr1的表达［29］，但是大量诱导xyr1需要Cre1［28］。里氏木霉突变株Iogen-M8与出发株Iogen-M4相比，木聚糖酶酶活得到显著提高，通过测序，发现位于xyr1锌指结构域的824位上的丙氨酸(Ala)突变成缬氨酸(Val)。将突变后的基因xyr1导入Iogen-M4后(菌株命名为Iogen-M4X)，木聚糖酶酶活也得到显著提高;同样将野生型基因xyr1导入Iogen-M8(菌株命名为Iogen-M8X)，木聚糖酶活与Iogen-M4基本一致。这就说明位于xyr1 824位上突变是提高Iogen-M8木聚糖酶活的关键因素。将Iogen-M8、Iogen-M4X和Iogen-M4分别培养在含有 50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L D-木糖、66 mmol/L D-木糖和1.5 mmol/L槐糖培养基中(以没有C源为对照)，发现在Iogen-M8和Iogen-M4X中，基因xyn1和xyn2表达量都维持在较为恒定的高水平，且基因cbh1和cbh2基础表达水平提高亦受槐糖诱导。这些说明里氏木霉突变株Iogen-M8中A824V突变，能够导致xyn1和xyn2表现出非常强的去调控现象，同时能提高cbh1和cbh2基础表达水平［30］。在米曲霉(Aspergillus oryzae)中，Xyr1同源蛋白XlnR是以不同的磷酸化形式存在的，向培养基中添加D-木糖使得XlnR的磷酸化形式发生变化［31］，但不清楚磷酸化改变是否影响 XlnR功能。在里氏木霉中，Ace2体外结合位点和Xyr1的结合位点相同，都为5'-GGCTAATAA-3'，但Ace2与启动子的结合需要磷酸化和二聚体化，而且还具有选择性。Ace2在调控xyn2基因中起作用:①抑制xyn2早期诱导;②增强xyn2后期持续表达［32］。AmyR是淀粉酶转录调控因子，但最近研究发现AmyR负调控纤维素酶基因表达［33-34］。

除了上述的转录调控因子外，最近还发现一些转录调控因子能够调控纤维素酶和半纤维素酶表达。在粗糙脉孢菌中，分别敲除2个具有锌指双核簇转录因子的基因clr-1和clr-2，这2个基因敲除菌株在微晶纤维素培养条件下生长出现严重缺陷，胞外蛋白分泌量只有出发株的5%，纤维素酶活、内切酶酶活及木聚糖酶活都检测不到，相对应基因的表达量也明显减少。这种生长缺陷也出现在纤维二糖培养条件下，但是在蔗糖、木聚糖生长条件下，此现象并没有出现。而且，在木聚糖培养条件下，敲除株的胞外蛋白分泌量及半纤维素酶活与出发株的基本一致。Clr-1对于粗糙脉孢菌有效利用纤维二糖是必需的，并且基因clr-2的转录受到基因clr-1调控［35］。在菌株 Δclr-2中，组成型表达clr-2不仅能够恢复在纤维素培养条件下生长及诱导纤维素酶的表达缺陷，而且在非诱导条件下，纤维素酶表达量能够达到野生型在微晶纤维素培养条件下的水平［36］。在构巢曲霉(A.nidulans)中，分别敲除clr-1和clr-2同源基因clrA和clrB，在纤维素培养基中，ΔclrA菌株纤维素酶酶活和木聚糖酶酶活是出发株的50%，菌株ΔclrB的纤维素酶酶活和木聚糖酶酶活几乎完全丧失［35］。在ΔclrB菌株中，组成型表达基因clrB虽然能在微晶纤维素培养条件下提高纤维素酶酶活，但不能在非诱导条件下充分诱导纤维素酶表达［36］。这些结果表明，基因clr-1/clrA和clr-2/clrB是功能保守并且非常关键的纤维素酶和半纤维素酶激活因子。

在曲霉中，还发现其他在特定条件下调控某些相关纤维素酶基因表达的转录因子。在棘孢曲霉(A.aculeatus)中发现一个具有Zn(II)2Cys6结构的转录因子clbR，它能显著激活不受XlnR调控的基因cbh1、cmc2和xynIa进行表达，同时对受到XlnR调控的基因cmc1和xynIb有激活作用。这种激活机制存在于纤维素培养条件下，而在D-木糖和L-阿拉伯糖培养条件下并没有这种机制［37］。在构巢曲霉中，发现1个能直接结合到基因eglA的启动子，属于SRF-type MADS box蛋白，在其编码区引入1个错义突变，在纤维二糖培养条件下能够显著减少纤维素酶的表达量［38］。Mikiko 等［39］报道了一个能特异调控β-葡萄糖苷酶的具有Zn(II)2Cys6结构转录因子的基因bglR，在里氏木霉中，BglR能上调β-葡萄糖苷酶表达，但却使菌株生产纤维素酶能力降低。

草酸青霉是山东大学自主分离纤维素酶高产菌株，经过多年不懈研究，对其调控纤维素酶和半纤维素酶机制有了很大进步［40-43］。笔者所在实验室研究发现:相对于150 r/min转速条件下，基因cbh1、cbh2、eg1、eg2 和 bgl1在 250 r/min转速条件下的表达量明显提高，但转录因子xlnR和ace1的表达量却下调。在里氏木霉中，Cre1能同时抑制基因ace11和xyr1表达。在草酸青霉中，通过提高转速来影响纤维素酶表达量的一个可能机制是草酸青霉感受到外界信号(可能是溶氧)后激活creA，CreA同时抑制基因xlnR和ace1表达。CreA同时介导去抑制和去激活，两者之间的竞争决定了最后纤维素酶表达量［40］。敲除草酸青霉中creA，发现内切酶、滤纸酶活及木聚糖酶酶活都显著提高，但对外切葡聚糖酶酶活及β-葡萄糖苷酶酶活没有影响。此外，CreA的缺失很可能影响斜卧青霉多条生长代谢途径，从而使该突变株菌落的形态与野生型相比发生了明显的改变(数据未发表)。CreA蛋白可与泛素结合，形成泛素化蛋白。泛素化的 CreA相对不稳定，容易受到蛋白酶的降解，CreB是去泛素化蛋白，能够稳定creA。同时还发现敲除creB能显著提高滤纸酶活、内切纤维素酶活、木聚糖酶活、外切纤维素酶活及胞外蛋白质含量［41］。相类似的工作在米曲霉和里氏木霉也有报道［42-43］。

2.2 染色质重建调控纤维素酶和半纤维素酶基因的表达

某些修饰组蛋白酶类，例如甲基转移酶、乙酰基转移酶，可通过参与染色质重建影响纤维素酶的表达［44-46］。Vu等［44］通过染色质免疫沉淀法研究发现稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)cel7c附近的组蛋白H3第4位上赖氨酸甲基化可能参与到羧甲基纤维素(CMC)介导的基因cel7c激活。通过敲除组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因moset1，敲除株在CMC培养基上基因cel7c的表达量明显减少，但在非诱导条件下，cel7c表达量明显增加。所以，MoSET1调控纤维素酶基因表达是受外界信号调节。在里氏木霉中，敲除组蛋白乙酰基转移酶基因gcn5、cbh1，突变株在诱导条件下表达量相对出发株明显减少，并且在cbh1启动子上的组蛋白H3第9、14位赖氨酸乙酰化程度显著减少，可以说明GCN5是通过乙酰化组蛋白H3来修饰染色质参与激活纤维素酶基因［45］。在里氏木霉基因组中，纤维素酶、半纤维素酶基因以及其他的cazy家族基因和一些次级代谢物合成基因位于相同的基因簇上。在曲霉中，甲基转移蛋白LaeA通过组蛋白水平调控次级代谢簇基因表达。Seiboth等［46］发现在里氏木霉中纤维素酶基因可能受到Lae1(LaeA同源蛋白)调控。通过敲除基因lae1后，主要的纤维素酶、木聚糖酶及β-葡萄糖苷酶基因都不表达，过表达lae1可以明显提高纤维素酶基因表达。基因xyr1的表达也受到Lae1调控。但是cazy家族在基因组编码区组蛋白H3第4位上Lys并没有发生二甲基化或三甲基化修饰，第9位上也没有发生三甲基化修饰。这些结果说明:Lae1对于纤维素酶、半纤维素酶基因表达是十分关键的，但可能不是通过甲基化组蛋白来调控纤维素酶基因表达。

除了上面提到的几个方面，笔者所在课题组在丝状真菌调控纤维素酶和半纤维素酶合成机制方面也有突破性进展［47-48］。Wang等［47］研究发现 MAPK 信号传导路径参与到纤维素酶基因调控中。在里氏木霉中存在3个MAPKs蛋白，分别为Tmk1、Tmk2和Tmk3。Tmk3属于Hog1-type类型MAPKs，敲除里氏木霉基因tmk3，导致在液态和固态培养条件下纤维素酶基因表达量及酶活都减少(液态条件减少程度更严重)，同时发现许多转录因子上含有tmk3的磷酸化位点。Tmk2属于Slt2类型的MAPKs蛋白，敲除基因tmk2后，主要的纤维素酶基因在液态培养条件下都发生了明显的上调，同时转录抑制因子cre1和ace2发生明显下调，转录激活因子xyr1和ace1并没有发生明显变化(未公开发表)。这说明Tmk3和Tmk2可能都参与到纤维素酶基因表达，但Tmk3可促进纤维素酶基因表达，Tmk2则抑制纤维素酶基因的表达。本课题组还发现分别在里氏木霉和草酸青霉中敲除同源性达到75%的Erp蛋白，都能造成菌体内部出现分泌压力，但是反馈调控纤维素酶及半纤维素酶基因的表达却出现截然不同的现象。草酸青霉中主要的纤维素酶基因都发生明显上调，在里氏木霉中主要的纤维素酶基因发生明显下调［48］。

3 展望

对丝状真菌合成纤维素酶和半纤维素酶机制的解析已取得了长足的进步，但相对丝状真菌上万年的进化，还有许多科学问题值得深入研究。转录因子方面，除了继续发现新的转录调控因子外，建立转录因子与各种信号传导路径直接相互关联是非常重要的。转录因子修饰是否能影响相关调控功能;哪些位点氨基酸对转录因子功能发挥是必需的。信号传导方面，仍然不清楚接受信号的直接受体是什么，同时信号如何向下游传递还需要努力探究。但是，相信通过坚持不懈的努力，会对整个丝状真菌合成纤维素酶和半纤维素酶调控网络有更深入了解，能够为进一步遗传改造工业菌株提供坚实的理论基础。

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