GlnR介导的代谢调控研究进展

江 湖， 田 健， 应 碧， 伍宁丰∗， 徐 波∗

1.江西农业大学生物科学与工程学院，南昌330045；

2.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

细菌代谢的有效性和适应性是众所周知的。它们进化出复杂且连锁的调控网络以应对几乎任何环境条件。为了能快速恰当地作出响应，细菌必须紧密监测必要营养的可利用性，如碳源、氮源、磷、硫、微量元素、阳离子和阴离子。细菌通过监测这些营养物质的胞外浓度、胞内累积，以及胞内的流动，把这些信号传递到调控蛋白从而作出响应［1］。

在很多革兰氏阳性细菌的基因组中，都存在glnR基因，其编码的蛋白GlnR是一种转录调控因子。GlnR最初是在天蓝链霉菌中被鉴定，它能使谷氨酰胺营养缺陷型回复成野生型［2］。研究证实，GlnR不仅在氮代谢的调控中扮演重要角色，也与磷酸代谢、抗生素合成等次级代谢途径以及细菌毒性存在交叉调控［3～6］。 目前，已有大量针对GlnR转录调控因子的研究。相关研究发现，在很多菌属中（如枯草芽胞杆菌、拟无枝酸杆菌、谷氨酸棒状杆菌、天蓝色链霉菌和耻垢分枝杆菌等），GlnR是氮代谢调控的一个全局性转录调控因子，它对很多参与氮代谢的基因都有调控作用。氮代谢途径的相关基因中，glnA、gdhA、glnPQ、amtB、nirBD、ureA、glnK 和 glnD 等均受GlnR 的调控［7～9］。

1 GlnR在不同细菌氮代谢调控中的作用

氮源是细菌生存最重要的元素之一，其中对氮源的有效吸收和同化是所有细菌生存最重要的能力。细菌进化出许多机制吸收各种各样的氮源［9］。氮源的同化与吸收和无机氮源掺入细胞代谢物，是几乎所有细菌的重要生理过程。不同氮源经过同化，形成了细胞内重要氮素来源的两种氨基酸，即谷氨酰胺和谷氨酸。铵几乎总是首选氮源，因为它能直接被同化成生物合成反应的关键氮素，即谷氨酰胺和谷氨酸。细菌存在两条铵同化途径：谷氨酸脱氢酶（GDH）途径和谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）途径［10，11］。 谷氨酰胺合成酶（GS）是氮代谢调控中的关键酶，其活力受到严格的调控，以保证谷氨酰胺的供应不会受到细胞可利用氮源的影响。

有关细菌氮代谢调控研究最初是在肠杆菌（Enterobacteriaceae）中进行的，并以此作为原核生物氮源调控的模式菌株，目前对枯草芽胞杆菌和链霉菌属的氮代谢调控研究也较为清晰。大部分微生物的氮代谢具有一个共同之处，即都是由一个全局性转录调控蛋白介导，GlnR就是这样一个全局转录调控蛋白。GlnR属于螺旋-转角-螺旋OmpR家族蛋白。但在革兰氏阴性肠杆菌中并不存在GlnR同源物，它们可以通过双元件系统调控谷氨酰胺合成酶的翻译，并通过可逆共价修饰调节谷氨酰胺合成酶的酶活［12］。同样在革兰氏阳性梭菌属中也未发现GlnR，它们通过反义RNA调节谷氨酰胺合成酶的水平［12，13］。因此也显示出微生物的氮代谢调节机制存在很大差异。

1.1 枯草芽胞杆菌中GlnR参与的氮代谢调控

枯草芽胞杆菌B.subtilis是低G+C含量革兰氏阳性菌最突出的模式菌株，其中至少存在3个调控蛋白CodY、GlnR和TnrA调控氮代谢相关基因的表达［15］。GlnR和TnrA是MerR家族转录因子的主要成员，能识别相同的操作子序列5′⁃TGT⁃NAN7TNACA⁃3′［16～19］。

枯草芽胞杆菌没有谷氨酸脱氢酶活性，只能通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶途径吸收铵。枯草芽胞杆菌的谷氨酰胺合成酶活力受反馈调节（feed back inhibited GS， FBI⁃GS），glnR 直接位于glnA上游，是双顺反子glnRA操纵子的一部分，GlnR具有一个α-螺旋-转角-螺旋结构域，形成二聚体并结合到glnRA操纵子的操作子glnRA01和glnRA02上，在氮源丰富时抑制 glnRA的转录［18，19］。 氮源贫乏时（如谷氨酸作为唯一氮源），glnRA操纵子的表达被TnrA抑制。氮源丰富时，GlnR也能抑制脲酶操纵子ureABC、tnrA基因以及几个受TnrA调控的基因的表达。TnrA和GlnR不仅调控了自身的表达，还彼此相互调节［20］。GlnR通过与谷氨酰胺合成酶相互作用，间接感应谷氨酰胺浓度，调节自身活性。尽管 GlnR和TnrA识别相同的序列，但GlnR不能调控某些TnrA的靶基因，这可能是由于GlnR对包含两个GlnR/TnrA识别位点的 DNA有较高的亲和性［11，19］。

1.2 放线菌中GlnR参与的氮代谢调控

放线菌能产生大量具有重要生物活性的次级代谢产物，是商业酶和药物的生产菌。GlnR在放线菌氮代谢相关基因的表达调控中起着重要作用，包括天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor）［21］、委内瑞拉链霉菌（S.venezuelae）［22］、地中海拟无枝酸杆菌（Amycolatopsis mediterranei）［23］、耻垢分枝杆菌（ Mycobacterium smegmatis）［7，24］、 戈 登 氏 菌（Gordonia）［25］和人源肺结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）［26］。

天蓝链霉菌是产抗生素链霉菌属的模式菌，与枯草芽胞杆菌不同的是，它的 GlnR是属于OmpR家族的转录因子，是细菌双组分系统典型的应答调控蛋白，不能调控自身的表达，据推测GlnR活性受一个未知的组氨酸激酶的磷酸化作用调节。氮源受限时，GlnR能激活天蓝链霉菌铵同化相关基因的表达，包括分别编码谷氨酰胺合成酶同工酶 GSⅠ⁃β和 GSⅡ的 glnA和 glnⅡ基因，以及编码氨转运蛋白的amtB基因。天蓝链霉菌还存在一个与GlnR很相似的OmpR家族调控蛋白GlnRⅡ，与glnⅡ相邻，GlnRⅡ能与glnⅡ上游序列相互作用。GlnRⅡ能识别大部分GlnR的靶标基因，glnR的缺失导致天蓝链霉菌的谷氨酰胺营养缺陷型，而glnRⅡ缺失突变株仍能在不含谷氨酰胺的最低限度培养基生长，GlnRⅡ在氮代谢中的作用目前还不清楚［27，28］。 Tiffer等［29］通过生物信息学手段搜寻包含相同GlnR结合序列的启动子，结合体外实验，在天蓝链霉菌中发现10个新的GlnR靶标，包括硝酸、尿素等多种氮源同化的基因和一些功能未知的基因。有趣的是，GlnR对其中一些靶标基因也有负调控作用，包括gdhA、ureA和其他一些功能未知的基因。最近，研究发现天蓝链霉菌中的硝酸盐还原酶编码基因nasA及硝酸盐同化相关基因nnar也受到GlnR的调控，但 GlnR识别序列与之前发现的稍有不同［27，30～32］。

分枝杆菌中，GlnR类似蛋白可以激活amt1基因、amtB⁃glnK⁃glnD 操纵子和 glnA 基因的表达，氮源受限时抑制亚硝酸盐还原酶基因nirB的表达。

1.3 乳酸乳球菌中GlnR参与的氮代谢调控

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是低G+C含量革兰氏阳性菌的模式菌株之一，由于具有多种氨基酸营养缺陷型［33］，关于其谷氨酰胺和谷氨酸代谢调控研究相对较少，因此对其氮代谢了解并不多。

Larsen等［34］通过构建乳酸乳球菌glnR缺失突变株结合DNA微阵列的方法，在乳酸乳球菌中发现了10个GlnR靶标，其中包括3个直接靶标glnRA操纵子、推定的铵转运及感应操纵子amtB⁃glnK和谷氨酰胺/谷氨酸ABC转运蛋白编码基因glnPQ。乳酸乳球菌 glnR缺失突变株中 glnA、amtB⁃glnK操纵子的表达被高度抑制，amtB⁃glnK启动子-35区上游的GlnR盒对GlnR介导的抑制作用极为重要。

在乳酸乳球菌中，GlnR和另外一个全局调控蛋白CodY在氮代谢调控中均起重要作用，在氮源丰富时CodY可能接管GlnR对amtB⁃glnK的调控。乳酸乳球菌的GlnR识别与枯草芽胞杆菌的GlnR/TnrA相同的转录操纵子序列，但二者只有一个共同的GlnR靶标，即glnRA操纵子，而乳酸乳球菌中受GlnR调控的glnPQ基因在枯草芽胞杆菌中受 TnrA 调控［7，18，19］。 因此，尽管乳酸乳球菌和枯草芽胞杆菌中的GlnR功能相似，但乳酸乳球菌的GlnR具有不同于枯草芽胞杆菌的氮代谢调控方式。

1.4 致病菌中GlnR参与的氮代谢调控

低G+C含量革兰氏阳性致病菌肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）中，GlnR 识别并结合与枯草芽胞杆菌相同的保守的操纵子序列，调控glnRA和glnPQ⁃zwf操纵子及谷氨酸合成酶编码基因gdhA的表达，GlnR的调控依赖于谷氨酰合成酶［33～36］。 Schreier等［5］通过回补金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的glnR到枯草芽胞杆菌glnR缺失突变株，发现金黄色葡萄球菌的GlnR与枯草芽胞杆菌GlnR有相似的功能，推测金黄色葡萄球菌中氮代谢基因同样受到类似的GlnR介导的调控作用。

2 GlnR与细菌其他代谢途径的交叉调控

GlnR不仅参与细菌的氮代谢调控，同时也与细菌的多种代谢途径存在交叉调控。

2.1 与次级代谢的交叉调控

天蓝链霉菌的双组份系统AfsQ1/Q2是抗生素合成和形态分化的一个多效性调节子［4］。AfsQ1/Q2通过直接激活途径特异性基因actⅡ⁃ORF4、redZ和 cdaR的表达，刺激放线菌紫素（actinorhodin，ACT）、十一烷基灵菌红素（undecyl⁃prodigiosin，RED）和钙依赖抗生素（calcium⁃de⁃pendent antibiotic，CDA）的合成。 AfsQ1/Q2 同时也是氮源同化的阻遏物，抑制GlnR靶标glnA、amtB和ureA的表达，并且可以与GlnR竞争结合glnA和nirB的启动子，而GlnR也可以与actⅡ⁃ORF4、redZ和cdaR基因各自的启动子结合，说明AfsQ1/Q2和 GlnR在氮代谢中存在交互调控作用。

Yu 等［23，37］发现地中海拟无枝酸杆菌在没有硝酸盐存在时，GlnR抑制利福霉素（rifamycin）的合成。将地中海拟无枝酸杆菌的glnR转入亲缘关系较近的天蓝链霉菌，研究表明GlnR广泛参与到宿主菌的次级代谢调控。因此，地中海拟无枝酸杆菌中，GlnR是氮代谢和相关抗生素合成的双功能调控蛋白。

2.2 与磷代谢的交叉调控

PhoR/P是磷酸代谢的全局转录调控因子，磷酸受限时，PhoP可以直接抑制glnR及GlnR靶标基因 glnA、glnⅡ和 amtB的转录。PhoR/P介导的磷酸代谢调控和GlnR介导的氮代谢调控也存在交叉调控［3，38～40］，GlnR 的调控作用已经超出初级氮代谢。

2.3 与其他代谢途径的交叉调控

2.3.1 嘌呤降解途径 氮源受限时，枯草芽胞杆菌可以启动嘌呤降解途径以获得充足氮源，脲酶操纵子ureABC的激活保证嘌呤被彻底降解成铵［41］。 Jaclyn 等［42］首次发现在枯草芽胞杆菌中，脲酶操纵子的表达同时受到GlnR介导的调控和嘌呤转运降解途径酶的调控。在枯草芽胞杆菌中，GlnR的抑制作用还依赖于谷氨酰胺合成酶的反馈抑制作用，FBI⁃GS可以激活GlnR与DNA的结合并稳定 GlnR⁃DNA 复合物［43］。

2.3.2 戊糖磷酸途径 Kloosterman 等［35］发现革兰氏阳性致病菌肺炎链球菌中，GlnR抑制戊糖磷酸途径代谢酶Zwf编码基因的表达。GlnR的调控作用依赖于GlnA，并且glnA和glnP缺失突变株对Detroit 562人类咽喉上皮细胞粘着性显著降低，表明这些基因影响了肺炎链球菌在宿主中的定殖。这也间接证明GlnR在肺炎链球菌毒性发挥中扮演着重要角色。

2.3.3 耐酸性应激效应 链球菌突变株的一个主要毒性特征就是其具有耐酸性应激效应（acid tolerance response，ATR）。citB基因编码的蛋白酶参与柠檬酸代谢途径中催化丙酮酸转化成α⁃酮戊二酸的反应，α⁃酮戊二酸为谷氨酸和谷氨酰胺提供碳骨架。Chen等［44］发现中性pH条件下，citB的表达被GlnR抑制，酸性处理30min后，这种抑制作用更为明显。酸性处理45min后，GlnR缺失突变株的存活率比野生型低10倍以上，回补后突变株的存活率恢复到和野生型一样，表明链球菌突变株的最佳耐酸性应激效应需要GlnR。

3 展望

革兰氏阴性肠杆菌中不存在GlnR，由双组分系统调控谷氨胺合成酶的转录，并通过可逆共价修饰调节谷氨酰胺合成酶的活性。肠杆菌中氮代谢调控研究，为革兰氏阳性细菌中GlnR介导的氮代谢调控研究作出重要的贡献。高通量技术的应用，如蛋白质组技术、DNA芯片技术等，为理清全局调控网络之间的复杂关系提供了有效手段。随着更多细菌基因组测序的完成，结合强有力的生物信息学预测手段，越来越多的GlnR靶标被发现，其中不乏间接靶标，但是GlnR对这些靶标基因的间接调控作用有待于进一步的研究。天蓝链霉菌中，新GlnR结合顺式作用元件的发现［29］，也为搜寻GlnR靶标基因提供了新的思路。深入研究GlnR在其他代谢途径中的作用，对进一步阐述GlnR参与次级代谢活性产物、细菌形态分化和细菌毒性等的调控具有重要的意义。此外，过去几年，虽然几个菌属中GlnR的调控模式已经研究得更加详细，但调控GlnR活性的信号和机制目前还不是很清楚，亟须更深入的研究。

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