实时荧光定量PCR技术在临床肿瘤检测中的应用

郑志芬，戴荣继

（北京理工大学生命学院，北京100081）

肿瘤是是机体在各种致癌因素作用下，局部组织细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，从而导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。学界将其分为良性和恶性两大类。肿瘤作为全球疾病致死的重要元凶之一，如果发现和治疗不及时，有可能导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损等，其后果极为严重。专家指出：在所有的肿瘤中约1/3的肿瘤可以预防，约1/3的肿瘤可以治愈，约1/3的肿瘤可以延长生命。目前，许多发达国家对于肿瘤的诊断与治疗多在早期，其中肿瘤标志物（如MiR-122等[1]）在肿瘤的诊断、分型、分期、预后诊断等[2-4]过程中发挥着重要的作用，所以肿瘤的实验室诊断检测意义重大。实时荧光定量PCR技术是在PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，是1996年美国Applied Biosystems公司推出，它是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，然后利用荧光信号的积累强弱实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知的DNA模板进行定量，实现了PCR从定性到定量的飞跃，为全面快速准确地分析样本中的各类待检物质提供了崭新的技术工具，现在已被广泛应用于实验室及临床肿瘤标志物的检测。

1 Real-Time PCR技术原理

实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上加入荧光标记探针（如标记荧光素的Taqman探针[5]）或者相应的荧光染料从而达到定量的目的。荧光标记探针是一寡核苷酸，其两端分别标记报告荧光基团和猝灭荧光基团，探针完整时，报告基团发出的荧光信号可以被猝灭基团吸收，从而无荧光信号产生，探针与任意一条DNA单链结合，当PCR开始扩增时，Taq酶将探针酶切降解，从而使报告基团与猝灭基团分离，荧光信号被荧光检测系统检测到。每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，从而实现了荧光信号与PCR产物的等比例增加，进而达到定量检测的目的[6]。

在荧光定量PCR技术中，一个很重要的概念Ct值：(C:Cycle，t: threshold即阈值，临界值)其含义是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的复制循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定的线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。所以利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标为起始拷贝数的对数，纵坐标为Ct值。因此，在实际操作过程中只要获得了未知样品的Ct值，即可通过标准曲线计算出该样品的起始拷贝数[7]。

实时荧光定量PCR方法分为绝对定量和相对定量，绝对定量是使用系列稀释已知浓度的标准品进行标准曲线的制作，从而对未知浓度的样品进行拷贝数的测定；相对定量是通过分别测定目的基因和参比基因的量，通过计算目的基因相对于参比基因的量，从而进行样品间相对量的比较，内参基因一般选择一些在细胞内或者各种状态下表达相对恒定的基因，如β-actin, GAPDH等；两种定量方法各有优缺点没有较大的可比性，对方法的选择只是根据实验目的、实验要求等选择较为合适的定量方法。

2 Real-Time PCR技术在肿瘤检测中的应用

2.1 Real-Time PCR 技术在肝癌检测中的应用

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）简称肝癌，是世界上临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居恶性肿瘤第5位，并且约有55%肝癌病例发生在中国，肝癌具有进展快、死亡率极高[8]等特点。付琳等[9]采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测PLAG1 mRNA 在健康人、肝硬化患者及肝癌患者血浆中的表达情况，其结果表明肝癌患者血浆中PLAG1 mRNA的表达量明显高于肝硬化者及健康人群，并且其表达量与病例分化程度相关，分化程度越低，PLAG1 mRNA 表达越高。这表明PLAG1 有望作为 “分子标志物”，成为新的肝癌诊断的分子生物学辅助指标，有研究[10]指出血清标志蛋白作为肿瘤标志物存在一定的缺陷，主要是由于这些蛋白的敏感性和特异性有时无法使人满意，也无法完整的诠释肿瘤复杂的分子进展过程，而诸如PLAG1 这些血浆中游离循环核酸作为“分子标志物”逐渐成为临床医学肿瘤诊断的研究重点。这一观点也为付琳等人的研究提供了理论支持。

除此之外，晋云等[1]采用Real-Time PCR技术检测了45例肝细胞癌及其配对癌旁组织中miR-122表达情况，其研究发现miR-122在肝细胞癌组织低表达，这与王跃华等[11]的研究结果一致， miR-122表达受抑制是肝癌的特征，其主要表现为侵袭能力增强、肿瘤复发和患者生存时间减少，研究指出miR-122的表达缺失可以诱发肝癌细胞获得侵袭表型。Tavazoie等[12]研究发现肝细胞癌中miR-12是一种与转型相关的miRNA。综上miR-122与肝细胞癌分型联系密切，采用Real-Time PCR技术同时联合免疫组化等方法对miR-122表达的检测对于肝细胞癌的分型判断具有重要作用。

刘懿霄等[13]采用TaqMan-PCR技术检测miR-429在癌组织、癌旁组织、肝癌细胞株及非肝癌细胞株中的表达情况，在138例病人中有47位患者发生肿瘤复发，并有72位患者发生死亡，5年期间肿瘤无复发率及病死率分别为60.1%和62.3%，研究发现对于miR-429来说，高miR-429表达与肝癌的不良预后相关。近年来也有越来越多的证据表明miR-429的表达与多种肿瘤相关，如结肠癌[14]、胃癌[15]、卵巢癌[16]。

2.2 Real-Time PCR 技术在乳腺癌检测中的应用

许多研究者认为乳腺癌是一种全身性疾病的局部表现，其治疗效果的好坏取决于确诊时是否远处转移。转移和复发是乳腺癌致死的主要原因，如果可以在亚临床状态就能检测到微转移，对临床的诊断、治疗及患者的预后都具有重要的指导性作用。早期乳腺癌复发转移的预测与防治是乳腺癌研究的前沿课题，尤其是外周血循环肿瘤细胞(CTT)及腋窝淋巴结微转移的检测逐渐成为乳腺癌研究的重点[17,18]。其中常见的标志性蛋白有乳腺上皮小黏蛋白（SBEM）、细胞角蛋白19（CK19）[19]及乳腺株细胞（hMAM）[20]等。

陈月凤等[21]采用巢式PCR技术及半定量PCR技术对47例乳腺癌患者和45例乳腺良性肿瘤患者外周血有核细胞中SBEM、hMAN和CK19的mRNA进行检测，研究结果显示：SBEM、hMAN和CK19在乳腺癌组织、癌旁组织及乳腺良性肿瘤中均高表达，具有高度敏感性，可以作为检测乳腺癌外周血、淋巴结微转移的标志。这一结论与Miksicek等[22]、杨华伟等[23]的研究结论一致。除此之外杨华伟等[23]还指出SBEM、hMAN和CK19等基因检测乳腺癌外周血微转移具有较高的灵敏度，但是缺乏特异性，在临床检测中最好采用联合检测以提高特异性。李文仿等[24]采用PCR技术检测hMAM在15例正常乳腺组织及15例乳腺增生组织中的表达情况，结果显示hMAM-mRNA在乳腺癌组织中高表达，这提示其有可能成为乳腺癌微转移检测的分子标志物，Tjensvoll K等[25]也提出高表达hMAM的患者肿瘤更易复发、转移，这也表明乳腺癌组织中乳腺珠蛋白表达成为乳腺癌的预后判断的重要依据。

张晓霞等[26]采用Real-Time PCR技术检测乳腺癌组织与正常乳腺组织中PDX-1和β-catenin mRNA的表达与分化程度、淋巴结转移及TNM分期之间的关系，结果显示PDX-1和β-catenin蛋白和mRNA的表达与乳腺癌的分化程度、淋巴结转移显著性相关，提示 PDX-1 和 β-catenin 可能参与肿瘤细胞的分化及转移过程，并提示PDX-1和β-catenin的检测对判断乳腺癌的预后有重要价值。在蛋白表达与乳腺癌微转移、预后等的检测中除了Real-Time PCR技术以外，反转录PCR[27]，免疫组化等方法也被大量采用。

2.3 Real-Time PCR技术在卵巢癌、肺癌、大肠癌等检测中的应用

卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，其具有发病隐匿，进展迅速的特点，仅有25%的卵巢癌能在Ⅰ期病变时被发现，大多数的患者诊断时都已扩散或转移，故卵巢癌的早期诊断[27,28]对于卵巢癌患者具有重要作用。人附睾蛋白4（HE4）是近年来发现的一个新基因，大量的研究表明HE4是一个优秀的鉴别卵巢良恶性病变的生物标志物[29]，Schummer等[30]采用Real-Time PCR技术进行检测，发现晚期卵巢癌经过手术和治疗，在复发前4~5个月就有HE4升高现象，提示HE4可用于检测卵巢癌复发。

魏明等[31]采用实时荧光定量PCR技术对不同临床分期和类型的肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20mRNA的表达水平进行联合检测，结果表明：I-Ⅱ期肺癌患者外周血中有阳性表达，Ⅲ、Ⅳ期CEA mRNA、CK19 mRNA的表达水平显著高于I-Ⅱ期，Ⅲ、Ⅳ期CEA mRNA、CK19 mRNA、CK20 mRNA的阳性率和表达水平明显高于I-Ⅱ期，其结论指出：应用荧光定量PCR技术检测肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20mRNA是反映肿瘤细胞血源性播散的灵敏性指标，但是单独检测某一肿瘤标志物，存在阳性率不高、特异性不强等特点，故选择联合检测多个指标以提高检测的敏感性和准确性。

Gao XH等[32]指出锌指蛋白zfp148表达水平和大肠癌的转移及预后关系密切，zfp148在转移性肿瘤的表达明显低于在原发性肿瘤，zfp148高表达肠癌患者术后预后乐观，这可能作为肠癌患者手术后一种重要的预后指标。岳昌武等[33]采用无血清悬浮培养结合CD13抗体标记磁珠分选获得Colo205来源大肠癌始动细胞，高通量测序分析180个锌指蛋白基因mRNA表达谱变化，并筛选差异表达基因，采用Real-Time PCR技术对部分差异表达基因进行表达变化验证，结果显示：与CD133-细胞群或未分选colo205细胞株比较，CD133+细胞群中有29个锌指蛋白在表达发生显著的改变，且表达变化趋势一致。这为大肠癌的分子诊断、治疗手段的确定以及预后的判断提供了参考。黄喆[34]采用Real-Time PCR技术对50例大肠癌患者肿瘤组织中Bmi-1 mRNA的表达情况进行检测，结果显示大肠肿瘤组织中Bmi-1 RNA以及Bmi-1蛋白的表达量较多，出现淋巴结转移的大肠癌细胞中Bmi-1 RNA及蛋白的表达明显高于未出现淋巴结转移的癌细胞，说明大肠癌淋巴结的转移与癌细胞中Bmi-1 RNA以及Bmi-1蛋白的表达密切相关；提示检测Bmi-1基因的表达水平对临床诊疗具有重要意义，但其是否能作为大肠癌诊断标志物尚需更多的数据进行证实。

3 Real-Time PCR技术存在的问题及其前景

实时荧光定量PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展起来，实现了将标准化的PCR检测技术成功广泛用于临床并且实现了DNA/mRNA的快速检测；与传统的PCR技术相比其使用了荧光探针标记特定核酸从而提高了准确性；灵敏度提高故使用较少的样本量，从而减少了样本消耗殆尽的风险，在一小时左右即可出结果，简化了传统PCR方法；全封闭管分析、利用电脑分析软件对PCR扩增产物的实时动态的检测和自动定量，定量动态范围高达五个数量级，且结果重现性较好，这也提高了检测的灵敏度和精密度。

实时荧光PCR技术在检测过程中会受到Taqman探针比例、mRNA的部分降解、同源与异源DNA背景、SYBR GreenⅠ的浓度大小、寡核苷酸杂交特性、PCR产物长短等因素的影响，从而造成结果偏差甚至假阳性结果，故在试验操作时必须对所设计的引物特异性进行充分的验证和条件的最优化探究；由于使用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，故无法实现传统的PCR技术检测扩增产物大小的功能；由于实时荧光PCR技术需要特殊的热循环仪和试剂，故目前使用成本较高，从而限制了它的使用；荧光素的种类及检测光源的局限性也限制了实时荧光PCR多重检测的能力。

实时荧光定量PCR的应用非常广泛。在科研方面，可定量分析各种基因的表达、突变和多态性、分析细胞因子的表达、单核苷酸多态性（SNP）测定及易位基因的检测等；在临床检测中，Real-Time PCR技术被广泛应用于免疫组分分析[19-21]、临床疾病早期诊断[26-30]、病原体检测[6]、耐药性分析[35]、肿瘤研究和微小残留病变（MRD）检测等；另外还可以在进出口检验、公安系统、考古与物种分类等方面发挥重要作用。随着技术的不断发展、科技的不断进步，实时荧光定量PCR与其他一些技术诸如反转录PCR技术[27]、免疫组化法[34,36]、HE染色法[36]等的结合应用，是今后发展的主要方向。而在肿瘤的临床检测中采用实时荧光定量PCR技术对多个基因进行联合检测[31]，进行综合性指标分析将成为今后的重点。

[1]晋云, 江行, 卿德科, 等. MiR-122在肝细胞癌中的表达及其与肿瘤表型标志物的相关性研究. 中华临床医师杂志, 2013,7(24):11259-11262.

[2]郭晓慧, 于小玲. 实时荧光定量PCR法检测卵巢良、恶性肿瘤中Id1 mRNA的表达. 现代肿瘤医学, 2011,19(11): 2299-2301.

[3]向华国, 曾锦婷, 何婉意, 等. PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒的研究. 中国病原生物学杂志,2012,7(5): 367-372.

[4]张昆丽, 谢芝勋, 滕丽琼, 等. 鸡白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α基因荧光定量PCR检测方法的建立. 中国畜牧兽医, 2013,40(9): 90-95.

[5]尹兵. 实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展. 科技信息,2010, 17: 30.

[6]吕艳芳, 马春颖, 励建荣. 实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用. 食品与发酵科技, 2014, 50(2): 80-84.

[7]Postollec F, Falentin H, Pavan S, et al. Recent advances in quantitative PCR (q PCR)application in food microbiology. Food Microbiology, 2011, 28(5): 848-861.

[8]洪双双, 杨玉秀, 白阳秋, 等. 多形性腺癌基因1与肝细胞癌关系讨论. 中华消化杂志, 2011, 1: 486-489.

[9]付琳, 杨玉秀, 白阳秋, 等. 肝癌患者血浆中PLAG1的异常表达.世界华人消化杂志, 2014,2,22(5): 630-636.

[10]Tsang J C, Lo Y M. Circulating nucleic acids in plasma/serum.Pathology, 2007, 39: 197-207.

[11]王跃华, 江涛, 张斌, 等. 肝细胞癌中miR-122的表达及其与血清AFP水平的关系. 临床肿瘤学杂志, 2012, 17: 704-707.

[12]Tavazoie S F, Alarcon C, Oskarson T, et al. Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis. Nature, 2008,451: 147-152.

[13]刘懿霄, 马韵, 黄小英, 等. MicroRNA-429表达与肝细胞癌预后的关系研究. 左江民族医学院学报, 2013,35(6): 758-761.

[14]Li J, Du L, Yang Y, et al. Mir-429 is an independent prognostic factor in colorectal cancer and exerts its ant-apoptotic function by targeting SOX2. Cancer Lett, 2013, 329(1): 84-90.

[15]Sun T, Wang C, Xing J, et al. MiR-429 modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells. European Journal of Cancer, 2011, 47(17): 2552-2559.

[16]Chen J, Wang L, Matyunina L V, et al. Overexpression of miR-429 induces mesenchymal to epithelial transition (MET)in metastatic ovarian cancer cells. Gynecol Oncol, 2011, 121(1): 200-205.

[17]李世超, 姜军. 乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性的研究进展. 中华肿瘤防治杂志, 2012,19(16): 1272-1275.

[18]陈政, 王晨, 左文述, 等. 乳腺癌前哨淋巴结微转移研究进展. 中华肿瘤防治杂志, 2012,19(19): 1512-1515.

[19]Godey F, Leveque J, Tas P, et al. Sentinel lymph node analysis in breast cancer: contribution of one-step nucleic acid amplification(OSNA). Breast Cancer Res Treat, 2012,131(2): 509-516.

[20]Lee G W, Kim J Y, Koh E H, et al. Plasma human mama globin mRNA associated with poor outcome in patients with breast cancer.Genet Mol Res, 2012,11(4): 4034-4042.

[21]陈月凤, 杨华伟, 莫钦国, 等. CK19和hMAM及SBEM检测乳腺癌微转移价值分析. 临床基础研究, 2014, 2, 21(3): 198-202.

[22]Miksicek R J, Myal Y, Watson P H, et al. Identi fi cation of a novel breast-and salivary gland-specific, mucin-like gene strongly expressed in normal and tumor human mammary epithelium. Cancer Res, 2002, 62(10):2736-2740.

[23]杨华伟, 陈月凤, 刘剑仑, 等. SBEM、hMAM及CK19预测乳腺癌外周血微转移的临床价值. 广西医学, 2013,35(11): 1450-1453.

[24]李文仿, 张华, 王明华, 等. 检测乳腺癌组织中乳腺珠蛋白mRNA的表达及临床意义. 胸部肿瘤, 2014, 4: 1312-1314.

[25]Tjensvoll K, Oltedal S, Farmen R K, et al. Disseminated tumor cells in bone marrow assessed by TWISTI, cytokeratin 19, and mama globin A mRNA predict clinical outcome in operable breast cancer patients. Clinical Breast Cancer, 2010,10(5): 378-384.

[26]张晓霞, 施华, 王爱军, 等. PDX-1、β-连接素在乳腺癌中的表达及预后关系的临床研究. 2014,24(4): 50-54.

[27]孙淑明, 林豪雨, 卢晓峰, 等. 外周血中PIP mRNA的表达及在乳腺癌微转移中的临床意义. 中国医药指南, 2014, 12(5): 5-7.

[28]Das P M, Bast R C. Early detection of ovarian cancer. Bio mark Med, 2008, 2(3): 291-303.

[29]Kondalsamy C S, Hackethal A, Bowtell D, et al. Differentiating stage 1 epithelial ovarian cancer from benign ovarian tumors using a combination of tumour markers HE4, CA 125, and CEA and patient's age. Gynecol Oncol, 2013, 129(3): 467-471.

[30]Schummer M, Drecher C, Forret R, et al. Evaluation of ovarian cancer remission markers HE4, MMP7 and Mesothelin by comparison to the established marker CA125. Gynecol Oncol, 2012,125(1):65-69.

[31]魏明, 涂玲, 梁颖红, 等. 肺癌患者外周血CEA mRNA、mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表达. 中国老年学杂志,2014,34(2): 490-491.

[32]Gao X H, Liu Q Z, Chang W, et al. Expression of ZNF148 in different developing stages of colorectal cancer and its prognostic value: a large Chinese study based on tissue microarray. Cancer,2013, 119(12): 2212-2222.

[33]岳昌武, 吕玉红, 周昕, 等. Colo205来源的大肠癌始动细胞锌指蛋白表达谱变化分析. 第三军医大学学报, 2014, 4.

[34]黄喆. 大肠癌干细胞基因Bmi-1表达与大肠癌组织病理特征的关系. 中国组织工程研究, 2014, 2, 18(6): 894-899.

[35]曾爱华, 何蕴韶, 李虎, 等. 实时荧光定量PCR检测乳腺癌5种多药耐药基因的表达强度. 陕西医学杂志, 2005, 34(2): 135-136.

[36]凌柯, 罗赤苗, 张爱国, 等. 小鼠H22皮下移植肝肿瘤模型构建及干预效果与分子机制初探. 湖南师范大学学报(医学版), 2013,10(4): 11-15.