多倍体技术在鱼类育种中的应用

李同明 孟令杰 季相山 王慧

特种动物

多倍体技术在鱼类育种中的应用

李同明①孟令杰②季相山①王慧①

（①山东农业大学 山东 泰安 271018 ②山东省定陶县孟海镇农业综合服务中心）

1 人工诱导多倍体的方法

人工诱导多倍体的方法主要有：物理学方法、化学方法和生物学方法。物理学方法与生物学方法安全无害，应用较多。

1.1 物理学方法 （1）物理学方法主要有静水压法、温度休克法和电休克法等。应用较多的是温度休克法和静水压法；也可以将不同的方法相结合，以提高人工诱导多倍体的效率。（2）静水压法是通过水压机产生的静水压来抑制第二极体的释放或抑制第一次卵裂，而使染色体倍数增加。其技术操作规程较为简单，条件易于优化和掌握，处理程序也易于标准化。因而，静水压法在鱼类的多倍体育种中有较多应用。其主要优点在于：诱导率较高，可达90%以上。处理时间短，一般为3~5min。对受精卵的损伤小，成活率高。（3）温度休克法包括冷休克和热休克两种截然不同的方法，其应用也较为广泛。冷休克法是指受精卵置于0~5℃(略低于其致死温度)的低温条件下几分钟，使其休克，以抑制第二极体的释放或抑制第一次卵裂，处理片刻后，立即恢复生存温度，可诱导出三倍体或四倍体的鱼；而热休克法则是将受精卵置于30℃(略高于其致死温度)的较高温度下，也可诱导出三倍体或四倍体的鱼。影响温度休克法诱导多倍体效果的关键因素有：处理的时机、持续时间和温度的高低。受精后立刻进行温度休克，可阻止第二极体的排出；若是在第一次有丝分裂的中期进行休克处理，可抑制第一次卵裂。（4）电休克法是通过电激使细胞融合而使染色体数倍增的技术，贾方钧(2001年)试验发现，受精卵分别在非电解质的甘露糖溶液和电解质的含5%小牛血清的细胞培养液中接受电激，细胞的融合效率差别不大，但融合后胚胎发育成活率有明显差别，细胞在非电解质溶液中接受点激的损伤较小，得到的多倍体后代成活率较高。不同鱼类受精卵接受电激的时机和时间不同，需要进行对比试验。（5）热休克与电休克方法相结合在诱导银大麻哈鱼三倍体中获得了成功，试验还发现，交流电诱导三倍体比直流电更有效，将受精40min的卵置于26℃并给以10min的10V交流电休克处理，可得到100%的三倍体虹鳟鱼。

1.2 化学方法 应用一些化学药品，选择适当的时机处理鱼类的受精卵，可有效地抑制第二极体的排出或抑制第一次有丝分裂，产生三倍体或四倍体鱼。其原理是：细胞松驰素B等化学药品可抑制纺锤丝内微管的形成，因而，可以干扰减数分裂或有丝分裂中纺锤体的正常收缩，使细胞分裂受阻，染色体加倍。常用于诱导多倍体的化学试剂还有：聚乙二醇(PEG)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、秋水仙素、咖啡因和N2O等。

1.3 生物学方法 （1）人工诱导多倍体的生物学方法主要有远缘杂交、核移植和细胞融合等。应用较多的是远缘杂交法。（2）远缘杂交主要是借助于异源精子的不亲和性而诱发染色体倍数增加，产生多倍体。远缘杂交技术易操作，应用较为广泛。鲤科不同亚种之间的远缘杂交，往往会可以产生多倍体。鳙(♂)×草鱼(♀)杂交会产生三倍体杂种鱼。草鱼、鳙及其F1的染色体组型分析结果是：草鱼与鳙具有二倍的染色体数(2n=48)，而F1全部具有三倍染色体数(3n=72)。鳙(♂)×草鱼(♀)杂交时，会同时出现二倍体杂种与三倍体杂种，但在二倍体的杂种中有35.1%的为畸形；而三倍体的杂种中仅5.1%为畸形。将草鱼(♂)与兴国红鲤(♀)进行远缘杂交，获得了异源四倍体杂种鱼。在三角鲂(♂)×草鱼(♀)的远缘杂交中获得了异源三倍体杂种，其中，草鱼提供了2个染色体组；而三角鲂只供了一个染色体组。（3）核移植是将供体细胞核转移或嵌入到去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程而被激活和进入细胞分裂和胚胎发育的过程中，这种方法可使核供体的基因得到完全复制。用四倍化的草鱼体外培养的细胞作为核供体，移植到泥鳅的去核卵内，获得发育到心跳期的四倍体胚胎。（4）核移植技术需要显微操作，难度较大，在实验室中有较多的应用，但在育种实践中的应用常受到限制。（5）细胞融合诱导多倍体的技术，是在人工诱导下，将两个不同基因型的细胞融合成一个杂种细胞的方法。该方法包括诱导囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵、受精卵与受精卵之间的细胞融合，但由于细胞内染色体发生重排，实际得到的是各种不同数量染色体的细胞群。所以，细胞融合在多倍体育种中的应用十分有限。（6）草鱼囊胚细胞与团头鲂受精卵的电融合，在98个卵中有73个融合卵发育至原肠胚(79.49%)，65个发育至心跳期(66.33%)，49个发育至仔鱼期(50%)，染色体计数在56~88之间，属于嵌合体。利用这一技术可以用来研究鱼类外源染色体对发育的影响和探索改良品种的可能性。

2 鱼类多倍体育种研究和应用现状

（1）多倍体育种技术有许多优越性，主要表现在：其一、能提高杂种后代的成活率，提高生长速度；其二，能控制性腺发育或性早熟，延长生长周期，显著提高品质、价格，显著提高经济效益。另外，还可以控制多倍体鱼类在自然水域环境中的自然繁殖，控制生物入侵现象。（2）许多研究发现，鱼类在生长过程中，很容易受到环境雌激素等污染物的影响，而发生性早熟现象，这会显著降低人工养殖鱼类的商品价值，使其生长速度降低，死亡率提高，个体偏小，达不到商品规格，而且其肉质和外观都较差；而性腺不育的三倍体鱼类，在耐水污染、耐寒和抗病性等抵抗恶劣环境方面具有明显的优势，性腺不发育，显著提高了其生长速度，明显地改善了鱼肉的品质，多倍体不育的鱼将性腺发育的能量全部集中在生长方面，自然会显著提高饵料的转化系数，获得较高产量和品质。异源四倍体有可能解决远缘杂交不育的问题；而三倍体育种对于控制一些鱼类的过度繁殖、防止基因混杂、改良种质资源和培育新品种具有独特的作用。所以，在鱼类人工诱导多倍体的研究中，三倍体和异源四倍体最常见和应用最为广泛，且已取得了一些实效。（3）日本成功地应用静水压法，大规模诱导生产出了马苏大马哈鱼全雌三倍体和牙鲆四倍体鱼。俄罗斯成功地开展了工厂化大规模培育鲤鱼三倍体的研究。（4）全雌三倍体虹鳟由于其不受性成熟影响而提高了商品规格，在加拿大已进行了商品化大规模生产；三倍体草鱼在美国天然水域中放养，用于除草，并能阻止其大量繁殖而破坏生态平衡。（5）用低温法成功地诱导了三棘刺鱼得到了三倍体，并且饲养到性成熟。目前，已经成功地获得了人工诱导多倍体的鱼类有30多种，分别为三棘刺鱼、鲽鱼、鲤鱼、尼罗罗非鱼、虹鳟鱼、大西洋鲑、泥鳅、草鱼、斑点叉尾鮰、鳙鱼、鲢鱼、白鲫等，有的已经开始用于生产，并取得了较明显的经济效益。（6）鱼类的多倍体育种在应用中也存在着许多不足和限制性因素，主要有诱导率还较低；多倍体鱼卵的孵化率偏低；人工诱导条件需要完善，如温度刺激时间、刺激强度、药物浓度和作用时间、刺激的时机等都尚需进一步优化；染色体倍数的鉴定方法需要建立。这些均需要进行更加深入的研究。

3 鱼类多倍体育种的应用前景

多倍体技术育种对于提高鱼类的产量、加快其生长速度、延长其寿命、控制其过度繁殖、保护鱼类种质资源和合理开发利用渔业资源等，都有着十分重要的作用。虽然，目前鱼类的多倍体育种还存在许多尚未解决的难题，但是，随着多倍体研究的不断深入和现代生物技术的迅速发展，鱼类多倍体育种技术将会不断地走向成熟，为水产养殖业的可持续发展作出更大贡献。

（2014–05–14）

S961.6

A

1007-1733(2014)08-0075-02