全反式维甲酸对星形胶质细胞清除淀粉样蛋白的影响及机制

韩 星，石 磊，严华成，曾晓晖，张 营，关 慧，赵树进

(1南方医科大学，广州510515;2广州军区广州总医院)

在阿尔茨海默病(AD)的发病机制中，脑内淀粉样蛋白(Aβ)产生与清除失衡，导致神经细胞内Aβ蓄积和沉积形成淀粉样斑块，以及Aβ的神经毒性是散发性AD最直接的病理因素［1］。在神经内源性免疫系统中，星形胶质细胞起着非常重要的作用。星形胶质细胞可以内化吞噬Aβ，降低神经细胞中Aβ含量［2］。维甲酸(RA)是机体正常发育不可越少的重要因子，RA信号参与调节胚胎发育，细胞增殖、分化、凋亡，维持正常的免疫功能，以及神经元的形成、存活［3］。在大脑皮层、海马等区域存在RA受体，RA对各种神经退行性疾病有神经保护性作用。全反式维甲酸(ATRA)是人体内RA最主要的活性成分，因此ATRA可能抵抗Aβ对星形胶质细胞的神经毒性，调节细胞内Aβ含量。2013年1～12月，我们观察了ATRA对星形胶质细胞清除Aβ的影响，并探讨其分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清(Hyclone)、DMEM/F12培养基(Hyclone)、MTT(Sigma)、ATRA(Sigma)、Aβ42(上海楚肽生物科技有限公司)、小鼠GFAP抗体(Epitomics)、IgG-FITC(SanTa Cuz)、DAPI(Sigma)、APOE(兔单抗，Abcam)、BACE1一抗(Millipore)、HRP Goat anti-Rabbit IgG(CST)、β-actin(CST)、小鼠β-Amyloid ELISA试剂盒(上海西塘生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养 取出生1～2 d的新生C57乳鼠的大脑，分离大脑皮层并剪碎，胰酶消化过滤，取滤液离心弃上清，加入DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清)吹打成细胞悬液，于37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验［4］。

1.2.2 原代细胞鉴定 取生长状态良好的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，山羊血清封闭液封闭2 h，同时用 0.1%Triton X-100 破膜。GFAP(1∶300)孵育，4℃过夜。FITC(1∶200)室温孵育2 h，同时用DAPI(10 μg/mL)染核。PBS冲洗，将细胞爬片转移至载玻片上，滴加甘油封片。正置荧光显微镜观察、拍照。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期细胞接种至96孔板，细胞数约为4 000个/孔，实验分为6组，每组设6个平行复孔。细胞贴壁24 h后，弃培养基。实验组中分别加入 200 μL含0.01、0.1、1、10 μmol/L 的 ATRA，且同时含有 2 μg/mL Aβ42培养基，对照组加入 200 μL 含有 2 μg/mL Aβ42培养基，正常组仅加入培养基。实验组培养24 h后向每孔内加入MTT 20 μL(5 g/L)，孵育4 h后弃上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min后酶标仪测定570 nm波长下各孔吸光度(OD)值，计算细胞存活率，细胞存活率=(实验组组OD值－空白对照OD值)/(对照组OD值－空白对照OD值)×100%。实验重复3次。

1.2.4 ELISA法检测Aβ含量 取对数生长期细胞分为对照组和实验组，每组设6个复孔。实验组加入含 2 μg/mL Aβ42 和 1 μmol/L ATRA 的培养基，对照组加入含2 μg/mL Aβ42的培养基，孵育24 h后，分别收集两组的培养基及星形胶质细胞。星形胶质细胞加入IP裂解液，收集上清液。采用小鼠β-Amyloid ELISA试剂盒分别检测培养基、星形胶质细胞内的Aβ含量。

1.2.5 Western blot法检测 APOE、BACE1 蛋白取对数生长期细胞，分为正常组、对照组和实验组，分别加入培养基、含 2 μg/mL Aβ42的培养基、含μg/mL Aβ42和1 μg/mL ATRA 的培养基，孵育 24 h后，分别收集各组星形胶质细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测总蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭:一抗4℃过夜，次日二抗孵育1 h。化学发光，显影，定影。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析条带光密度值。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件统计，结果以±s表示，两组间比较采用t检验(并做方差齐性检验)，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代星形胶质细胞纯度鉴定 采用GFAP、DAPI共染细胞的方法鉴定星形胶质细胞。GFAP免疫荧光阳性者呈绿色荧光，即为星形胶质细胞。结果显示，星形胶质细胞纯度＞95%。

2.2 不同浓度ATRA对星形胶质细胞存活率的影响 正常组、对照组及 0.01、0.1、1、10 μmol/L 实验组的细胞存活率分别为(100±3.57)%、(88.7±1.96)%、(93.3 ±2.93)%、(94.7 ±2.27)%、(95.1±1.88)%、(89.7 ±2.40)%。对照组存活率明显低于正常组，各实验组存活率均高于对照组(P＜0.05或 ＜0.01)。

2.3 ATRA对星形胶质细胞Aβ清除的影响 对照组与实验组细胞外培养基中Aβ的相对表达量分别为(100 ±2.36)%、(100 ±1.49)%，细胞内培养基中Aβ 的相对表达量分别为(85.53 ±7.71)%、(59.30 ±1.11)%。实验组细胞内和细胞外培养基中的Aβ含量较对照组均明显下降(P＜0.05或＜0.01)。

2.4 ATRA对BACE1、APOE表达的影响 正常组、对照组、实验组的APOE相对表达量分别为0.194±0.030、0.413 ±0.062、0.472 ±0.098，BACE1 相对表达量分别为 0.129 ± 0.030、0.138 ± 0.045、0.114 ±0.036。对照组APOE表达较正常组明显增加，实验组较对照组明显增加(P均＜0.01)。各组BACE1表达无统计学差异(P均＞0.05)。

3 讨论

Aβ是β-分泌酶和γ-分泌酶的综合裂解产物，是神经退行性疾病的生物标志物［5］。Aβ的聚集、沉淀形成淀粉样斑块，进而诱发胶质细胞的神经炎症反应，导致神经功能紊乱，是AD的主要病理变化［6］。星形胶质细胞在维持CNS的内环境稳态中发挥重要作用，同时也是CNS系统中最重要的免疫细胞。

APOE ε4等位基因是散发型AD的主要危险因子，APOE4对Aβ的亲和力低的缺陷导致细胞内Aβ清除减弱，从而促进 Aβ 聚集［7］。但 APOE2、APOE3对Aβ更具亲和力，抑制Aβ聚集，促进内含体对Aβ的内吞作用，增加细胞内 Aβ的清除［8］。Cramer等［9］研究发现，过氧化物酶增殖激活受体激动剂贝莎罗丁可以直接诱导AD转基因APOE表达上调，增加脑内Aβ的清除，明显改善小鼠的认知功能障碍。因此认为，APOE2、APOE3能够促进细胞内Aβ的清除，对神经细胞具有保护性作用。

RA信号通路参与调节胚胎发育，细胞增殖、分化、凋亡，维持正常的免疫功能，以及神经元的形成、存活［10］，参与神经退行性疾病的发生与发展，与AD有密切联系。本研究发现，ATRA可以促进APOE的表达显著增加，减少星形胶质细胞内Aβ聚集，具有一定的神经保护作用。这可能由于ATRA信号可以激活 LXR/RXR、PPARγ/RXR等受体，诱导APOE、ABCA1等表达上调，增加 Aβ的清除率［10，11］。同时发现高浓度的 ATRA 对星形胶质细胞具有一定毒性，其分子机制不明确。ATRA具有抗氧化应激损伤、抗炎作用、促进 α-分泌酶裂解APP、诱导ApoE表达等作用，其分子机制涉及各个环节［12，13］，仍需进一步深入研究。

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