舒芬太尼后处理对缺血/再灌注大鼠心肌线粒体Cx43蛋白表达的影响

徐红梅，褚海辰，牛泽军，李红梅

(青岛大学附属医院，山东青岛266003)

研究［1，2］发现，缺血或药物性干预可减少心肌缺血/再灌注损伤。目前研究［3～5］证实，吗啡、芬太尼、瑞芬太尼等阿片类药物具有药物后处理作用，能保护缺血/再灌注损伤的心肌。舒芬太尼是一种人工合成的阿片类镇痛药物，最近，国内外关于舒芬太尼预处理及缺血后处理对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用研究较多，但其保护机制仍不明确。缝隙连接蛋白43(Cx43)是细胞连接通讯中的重要物质。研究［6，7］发现，心肌线粒体 Cx43对维持线粒体稳定有重要作用，其通过调节活性氧自由基的生存触发对心脏的保护作用，其数量和磷酸化水平与缺血处理对心脏的保护作用相关。2012年7月，我们观察了舒芬太尼后处理对缺血/再灌注大鼠心肌线粒体Cx43蛋白表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD雄性大鼠60只，清洁级，体质量250～300 g，由青岛大学医学院生理教研室提供。

1.2 药品与试剂 NaHS、氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司，美国);心肌线粒体提取试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司);兔抗磷酸化Cx43(Ser368)抗体(#3511，Cell Signaling)，兔抗总 Cx43抗体(71-0700，Invitrogen);碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物公司);SDS-PAGE凝胶配试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天，中国)，BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(S3771，Promega)。

1.3 心肌缺血/再灌注损伤模型建立方法 以乌拉坦5 mL/kg的剂量腹腔注射于大鼠进行麻醉，将心电图电极插入大鼠四肢皮下，并记录正常Ⅱ导联心电图。将大鼠气管切开，连接动物呼吸机，行机械通气，呼吸频率60次/min，潮气量18 mL/kg。沿大鼠左侧胸壁第3、4肋间行纵向切口开胸，并逐层钝性分离打开胸腔，然后破开胸膜及心包膜，充分暴露心脏，并于左心耳下方1～2 mm处即冠状动脉左前降支(LAD)处穿行7-0缝线，在无创缝合线末端通过一塑料管，通过向下推动塑料管压向心室壁阻断冠状动脉血流，放松无创缝合线造成再灌注。LAD结扎成功标志:结扎处以下心肌组织发绀，活动减弱，心电图显示ST段明显抬高;再灌注成功标志:结扎线松开后，心肌局部反应性充血，ST段下降。

1.4 实验分组及舒芬太尼后处理方法 将60只大鼠随机分为4组各15只，假手术组(A组)只穿线，不结扎;缺血/再灌注组(B组)结扎LAD，缺血30 min后，再灌注120 min;缺血后处理组(C组)结扎LAD，缺血30 min末行缺血30 s，再灌注30 s，重复3次，再灌注120 min;舒芬太尼后处理组(D组)结扎LAD缺血30 min，再灌注前5 min，静滴舒芬太尼0.1 μg/kg，再灌注120 min。再灌注末取大鼠心脏，置于-80℃冰箱冷冻保存。

1.5 心肌梗死面积测定方法 将大鼠的心脏横切2 mm薄片4～6片，放入1%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液中(pH=7.4)，37℃ 水浴箱中闭光孵育10 min，存活心肌呈砖红色，梗死心肌呈灰白色。染色对比明显后拍照，Adobe photoshop version7.0软件计算心肌梗死面积百分比(MIS%)，MIS%=(心肌梗死面积之和/心肌总面积之和)×100%。

1.6 心肌线粒体总 Cx43(tCx43)和磷酸化 Cx43(pCx43)测定方法 取大鼠左心室100 mg，0～4℃下快速剪碎心肌，玻璃匀浆器中匀浆10次。采用北京宝赛公司的心肌线粒体提取试剂盒分离线粒体，将匀浆液12 000 g于4℃条件下离心10 min，取上清，12 000 g于4℃条件下离心10 min，弃上清，沉淀为粗制线粒体。以上操作均在4℃进行，1 h内完成。取线粒体沉淀1滴涂片，滴加1%詹姆斯绿B染色20 min，覆上盖玻片，镜检，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。Folin酚法测蛋白浓度，配平煮沸，取等量心肌样本进行SDS-PAGE电泳，分离后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入一抗(pCx43，1∶1 000 稀释;tCx43，1∶500稀释)，4℃孵育过夜，TBST室温漂洗后加入二抗(碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG，1∶500稀释)，室温振荡孵育2 h，漂洗后BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒显色，扫描条带，将图像转换成数字图像，用Image J图像分析软件对蛋白条带进行半定量分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

A、B、C、D 组的 MIS%分别为 0.8% ±2.4%、44.6% ±5.3%、37.4% ±3.7%、26.5% ±4.2%，D组与B、C组相比，P均＜0.05。以B组心肌线粒体tCx43和pCx43电泳条带灰度为基准，A、B、C、D组心肌线粒体 tCx43 灰度比分别为2.3、1.0、1.3、1.8;pCx43 灰度比分别为2.4、1.0、1.3、1.6。B 组有少量tCx43和pCx43蛋白表达;D组tCx43和pCx43蛋白表达明显高于B、C组(P均＜0.05)。

3 讨论

心肌缺血/再灌注是指在较长时间心肌缺血的基础上，恢复血流灌注，即复灌后缺血的器官和组织损伤并不减轻，反而加重甚至发生不可逆行损伤的现象［8］。缺血预处理是临床常用的心肌内源性保护方法［9］，Schultz等［10］发现，给予麻醉大鼠纳洛酮后缺血预处理的保护作用取消，推测阿片类受体可能参与心肌缺血/再灌注损伤保护作用。由于心肌缺血/再灌注的发生在临床上难以预测，所以缺血后处理比缺血预处理在临床上更为常用。而药物后处理可以避免缺血后处理所造成的血管机械性损伤，因此，药物预处理越来越受到重视。阿片类药物作为一种麻醉药物广泛用于临床，其对心肌的保护作用有不少报道。舒芬太尼是芬太尼N-4位取代的衍生物，作为一种新型的高选择性μ阿片受体激动剂，具有半衰期短，清除率高，镇痛强度大，轻易穿透细胞膜和血脑屏障，心血管功能稳定，反复给药后蓄积作用少的特点。在麻醉诱导、气管插管和恢复期比吗啡、芬太尼、哌替啶等有更好的应用条件［11，12］。研究［13］发现，舒芬太尼可通过PI3/Akt信号通路发挥对大鼠心肌缺血/再灌注心肌的保护作用。

Cx43是构成哺乳动物心肌缝隙连接通道的主要蛋白，通过由其组成的非连接性半通道在细胞容积的调控及胞质释放ATP和代谢产物中发挥作用，在心肌缺血/再灌注时极易被降解［6］。生理条件下，心肌Cx43多处于磷酸化状态，即使缺血前几分钟，Cx43仍维持其磷酸化状态不变，但随缺血时间延长，Cx43发生脱磷酸化和电失偶联。研究［14］表明，在鼠类乳腺上皮细胞中可通过PI3/Akt信号通路调节Cx43表达。本研究发现，B组心肌梗死面积增加，线粒体Cx43总量和磷酸化量减少，D组心肌梗死面积减少，线粒体Cx43总量和磷酸化量增加，可见线粒体Cx43在舒芬太尼后处理减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤中起重要作用。这与Gorbe等［15］研究发现细胞质和线粒体中Cx43的相应减少，去磷酸化的Cx43相应增多，能明显增加缺血/再灌注心肌损伤的结果一致。

综上所述，舒芬太尼可能通过增加缺血/再灌注大鼠心肌线粒体Cx43蛋白表达发挥心肌保护作用。

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