CD4+CD25+Treg细胞与肿瘤免疫研究进展

王 彩综述 魏素菊审校

机体免疫系统通过免疫监视功能，识别和清除包括肿瘤、微生物等“非己”成分，维持机体的稳定。恶性肿瘤在机体内往往表现出免疫逃逸的特殊状态，与机体抗肿瘤的免疫效应之间形成一对此消彼长的矛盾关系。近些年研究发现，CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)可通过抑制激活的 T 细胞功能，影响机体抗肿瘤免疫作用，在维持自身免疫耐受性中发挥着重要作用，与肿瘤免疫逃逸关系密切[1]。机体的细胞免疫受抑是肿瘤发生、发展、转移和复发的重要原因。许多肿瘤患者的外周血和肿瘤组织中的Treg细胞比例升高，往往提示着预后不良[2]。因此，近年来通过调节CD4+CD25+Treg 细胞的数量或功能来增强机体抗肿瘤免疫成为肿瘤免疫治疗的焦点。本文就CD4+CD25+Treg细胞的生物学特征、免疫抑制机制及其在肿瘤免疫中的作用作一综述。

1 CD4+CD25+Treg细胞概述

1.1 CD4+CD25+Treg细胞的分类及分子标志

1995年，Sakaguchi等首次报道在人和小鼠的外周血中有 5%～10%的CD4+T 细胞持续高表达 CD25分子，去除这群T细胞的裸鼠会发生多种自身免疫性疾病，而将去除的细胞群重新回输，则可预防疾病的发生。这一现象提示CD4+CD25+T细胞有可能是维持自身免疫耐受的重要因素，对免疫功能具有调节作用,随之产生了调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)的概念。此后，该类细胞逐渐成为免疫学研究领域的热点。目前认为Treg细胞是1个异质性群体，根据其来源和效应机制分为两类：天然型CD4+CD25+Foxp3+Treg(nTreg)和诱导性Treg(iTreg)[3]。nTreg在胸腺中产生，成熟后迁移至外周淋巴系统。它占外周血CD4+细胞的5%～10%，表达IL-2 受体的α 链(即CD25)，主要通过与效应细胞之间的直接接触介导免疫抑制作用，从而维持机体免疫耐受及抑制自身免疫性疾病。iTreg细胞主要由外周成熟的CD4+T细胞在特定的抗原和(或)IL-2、TGF-β 等细胞因子的诱导下转化为具有Treg 细胞功能特征的细胞群。iTreg可分为Tr1(CD4+CD25+/-Foxp3-IL-10highregulary1 T cells)和Th3(CD4+CD25+/-Foxp3-TGF-βhighhelper3 T cells)2种亚群，分别主要通过分泌IL-10和TGF-β等细胞因子介导免疫抑制功能。除上述两大类Treg细胞外，CD8+CD28-Treg、CD3+CD4-CD8-Treg和外周血天然杀伤 T 细胞等[4]其他一些Treg 细胞也逐渐被人们所认知。

CD4+CD25+Treg细胞可表达多种分子，如抑制性共刺激分子 CTLA-4、肿瘤坏死因子受体超家族成员GITR、Toll 样受体4、趋化因子受体CCR4、程序性死亡受体1、淋巴细胞抗原复合体6等。其中某些分子曾作为Treg细胞的常用标记，但由于它们同时也表达于活化的效应性淋巴细胞表面,因此这些分子的表达缺乏特异性。

叉头样转录因子家族成员Foxp3是目前人CD4+CD25+Treg细胞比较特异的形态和功能性指标，在Treg细胞的发育、分化和成熟以及功能维持方面起着重要作用，被认为是CD4+CD25+Treg细胞的最敏感标记[5]。Foxp3在Treg细胞的组成性表达是该细胞亚群发挥功能的前提。人类同源基因 Foxp3的突变可引起X染色体性联综合征。然而，Foxp3是细胞核产物，不在细胞表面表达，因此不能直接单独作为Treg细胞的选择性标记。

大多数人类CD4+T 细胞可表达 CD127分子(IL-7受体的一条链)。研究显示，CD4+CD25+Treg细胞低表达 CD127分子，并且CD127 与 Foxp3 的表达呈负相关。联合应用CD25 和 CD127可得到高纯度的 Treg 细胞。另有研究发现CD49d与Foxp3的表达也呈负相关，CD49d与CD127 联合检测有助于得到高纯度的Treg 细胞。

1.2 CD4+CD25+Treg细胞的免疫功能特性

CD4+CD25+Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征。前者表现为对IL-2单独刺激或CD3单抗和CD28单抗联合作用呈低反应状态，也不分泌IL-2，但在高浓度IL-2或抗CD28单抗刺激下并经T 细胞受体(TCR)介导信号，CD4+CD25+Treg细胞可活化并增殖；后者表现在经TCR介导的信号刺激活化后能抑制CD4+和CD8+T细胞和B细胞的活化和增殖，并且这种免疫抑制性不具有MHC限制性，即为非抗原特异性，能够抑制同种同型或同种异型T细胞的增殖。

2 CD4+CD25+Treg细胞介导的免疫抑制机制

Treg细胞对效应性T细胞的抑制作用可以通过细胞接触和分泌细胞因子方式实现。随着对参与Treg细胞免疫调节活动的效应分子研究的逐步深入，依据分子特性及功能的不同，可将 Treg细胞介导的免疫抑制机制概括为4种基本途径。

2.1 依赖抑制性细胞因子的途径

nTreg细胞分泌多种免疫抑制性细胞因子，其中转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-10被认为是介导Treg细胞免疫抑制的关键因子。TGF-β 对机体多种免疫细胞的生长、分化具有重要的调节作用。它可抑制IL-1和IL-2的分泌，进而抑制T细胞增殖。Frimpong-Boateng 等[6]发现，Treg 细胞可通过分泌 TGF-β 抑制NK细胞的杀伤功能。此外，TGF-β可抑制巨噬细胞和树突状细胞表达共刺激分子[7]，从而抑制抗肿瘤免疫反应。IL-10可以抑制单核细胞、NK细胞的活化及Th1细胞合成IL-2等细胞因子，抑制DC和巨噬细胞 MHC-Ⅱ类分子的表达及降低抗原提呈作用，从而起到免疫抑制的功能。Miriam 等[8]证实黑色素瘤组织中的IL-10能降低特异性细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的灵敏性，并抑制瘤抗原提呈。此外，Treg细胞可高表达CD25(IL-2受体的α链)，竞争性结合T细胞增殖的关键因子IL-2，从而抑制效应T细胞增殖分化。同时Treg 细胞结合 IL-2后又可促进自身增殖分化，进一步增强对效应 T 细胞的免疫抑制作用[9]。纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogenfi-like protein 2，FGL2)是Treg细胞的另一种重要的抑制因子，可通过FcγRⅡb受体介导免疫抑制效应，被认为是Treg细胞发挥功能的标记[10]。靶向去除小鼠中的FGL2，会导致DC、T、B细胞的免疫反应增强和自免性肾病的发生。

2.2 破坏细胞代谢的途径

Treg细胞可破坏效应靶细胞的稳态、代谢途径及信号传导通路，继而抑制其免疫反应。第二信使cAMP则参与了该过程。Treg细胞通过缝隙连接将cAMP直接导入靶细胞，通过消耗 IL-2诱导靶细胞凋亡。Treg细胞也可通过增强腺苷酸依赖的信号传导，间接提高靶细胞内cAMP水平。此外，Treg可通过CD39和CD73水解ATP酶，提高细胞微环境中腺苷酸水平，进而活化效应细胞上腺苷酸受体A2A，产生免疫抑制作用[11]。腺嘌呤二核苷酸(NAD)可影响Treg细胞表型和功能，它可通过细胞溶解或非溶解的方式释放入胞外，通过ADP糖基化活化P2X7受体，继而介导T细胞死亡。

2.3 溶解细胞的途径

Treg细胞可通过释放颗粒酶A/B、穿孔素或通过TRAIL-DR5(肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体-死亡受体-5)途径直接杀伤效应细胞，起到免疫抑制作用。人源CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞在抗CD3和CD46抗体共同作用下活化,可诱导表达颗粒酶 A(granzyme A)，通过穿孔素依赖机制去除活化的 CD4+和CD8+T细胞，CD14+单核细胞和成熟及未成熟的DC。此外，靶细胞可通过过表达颗粒酶特异性抑制剂，抵抗细胞死亡。Suzan等[12]发现在体外试验中，去除颗粒酶B的Treg细胞对CD8+T细胞扩增的抑制作用减弱。人源和鼠源Treg细胞可高表达溶细胞半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-1表达不足的鼠源Treg细胞在体外试验中显示免疫抑制功能受损。

2.4 调节抗原递呈细胞(APC)功能的途径

Treg细胞介导的免疫抑制还可通过调节抗原递呈细胞的功能间接实现，其中某些抑制性膜相关分子在该途径中发挥重要作用。最具代表性的就是细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)，它也是Treg 表达的重要分子标记，可与DC表面的CD80和CD86共同作用，诱导抗原递呈细胞(DC为主)产生吲哚-2，3-加双氧酶(IDO)，该酶可降解细胞代谢必需的色氨酸，色氨酸缺失会抑制 T 细胞活化，从而导致T细胞凋亡。此外，CTLA-4还可通过与B细胞、T细胞、DC和巨噬细胞上的配体B-7结合，抑制靶细胞的活化与增殖。Wing 等研究发现，CTLA-4 诱导缺陷的荷瘤小鼠可发生全身性淋巴细胞增殖，产生显著的抗肿瘤免疫反应，引起肿瘤消退。

有研究发现另一种膜相关抑制因子，即淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activationgene-3，LAG-3/CD233)。它是表达于Treg细胞上的跨膜蛋白，也是CD4分子相关黏附蛋白，可与抗原递呈细胞的MHCⅡ结合。当Treg和DC相互作用时，LAG-3与MHCⅡ结合后会诱导免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)介导的抑制信号通路，产生负向信号，继而抑制DC成熟，下调其免疫激活的能力。体内外试验均显示应用LAG-3抗体可阻断Treg细胞抑制功能。然而LAG-3缺失小鼠未发生自免性疾病。

3 CD4+CD25+Treg细胞在肿瘤微环境中的分布及意义

CD4+CD25+Treg细胞以其独特的免疫抑制作用，影响机体抗肿瘤免疫，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，并进一步影响肿瘤的转归和预后。很多证据表明在肺癌、乳腺癌、宫颈癌及肾癌等不同恶性肿瘤患者的外周血、肿瘤局部及肿瘤浸润淋巴结中，CD4+CD25+Treg细胞比例增高，并显示出与疾病进程及预后呈负相关。Shah等[13]证实肿瘤局部浸润CD4+Fox3+Treg细胞比例较高的宫颈鳞癌患者，其5年生存率显著降低。Shen等[14]发现胃癌患者中，瘤内Fox3+Treg细胞比例增高者的总生存期相对缩短。Mahmoud等[15]报道乳腺癌患者外周血及癌组织中可检测到Treg细胞比例增高。同时，单因素分析显示瘤内及癌旁基质中Fox3+Treg细胞数目与乳腺癌患者的预后呈负相关。Bachy等[16]发现慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血Treg细胞水平升高，化疗后未完全缓解组Treg细胞水平比完全缓解组高。Lin等[17]报道瘤内Foxp3+Treg细胞比例与肝细胞癌患者的预后呈负相关。Liotta等[18]研究证实在肾细胞癌患者的肿瘤浸润淋巴结和外周血中Treg细胞数均上升，且前者升高显著，并与预后不良相关。Kang等[19]进一步发现对于肾透明细胞癌患者，肿瘤浸润淋巴结中增高的Treg细胞可作为总生存率的独立预测指标之一，并与增高的远处转移率和降低的无复发生存率密切相关。Shimizu等[20]报道肿瘤浸润Foxp3+Treg细胞数目与淋巴结阴性非小细胞肺癌患者的无复发生存率呈负相关。上述众多研究结果表明Treg细胞在多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤的微环境中普遍增高，并且与肿瘤转归及预后有密切关系。

肿瘤微环境中CD4+CD25+Treg细胞积聚的具体机制仍不明确，可能与以下因素有关：①肿瘤细胞可通过分泌IL-10、IL-2和TGF-β等因子诱导CD4+CD25+Treg细胞扩增，并诱导CD4+CD25-Treg向CD4+CD25+Treg细胞转化；②肿瘤细胞分泌的CCL22可与CD4+CD25+Treg细胞表达的CCR4(趋化因子CCL22受体)相结合，继而使Treg细胞在肿瘤局部富集；③抗原递呈细胞可通过肿瘤相关抗原进一步扩增CD4+CD25+Treg 细胞；④在由Fas-Fasl介导的凋亡中，CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T细胞存在敏感性上的差异，肿瘤通过分泌细胞因子选择性地诱导 CD4+CD25-T细胞凋亡[21]。

肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的重要作用已被广泛认可。然而与上述研究结果有所不同的是，肿瘤局部积聚Foxp3+Treg细胞，并非总与预后不良相关。某些肿瘤，尤其是结直肠癌，局部Foxp3+Tregs的比例与预后呈正相关。Salama等发现肿瘤浸润组织中Foxp3+Treg细胞比例较高的结直肠癌患者，其生存期相对延长。这一发现已被Frey等[22]证实。Bron等[23]报道在口咽癌、口腔鳞癌患者和淋巴结未转移的头颈部鳞癌患者中，肿瘤浸润Foxp3+Treg细胞普遍增多，并与延长的总生存期相关。Lee等[24]研究发现三阴性乳腺癌患者的肿瘤局部积聚的Foxp3+Treg细胞与其延长的生存期密切相关。在典型的霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤中高水平的Treg细胞可改善患者生存率[25]。对于这些研究结果，不排除某些肿瘤的预后可能更多的是与激活的CD4+或CD8+T细胞相关，并非仅是Foxp3+Treg细胞。然而，现有研究尚未能对此做出合理解释。目前多数学者认为Treg细胞能抑制机体抗肿瘤免疫，促进肿瘤发展。肿瘤微环境中Treg水平的升高往往提示预后不良。

4 CD4+CD25+Treg细胞与肿瘤免疫治疗

肿瘤的免疫治疗已成为继手术、放射治疗和化学治疗之后又一种重要的治疗手段。最近的研究[26]表明Treg细胞在肿瘤治疗中的作用是复杂多样的。尽管如此，体内清除Treg细胞可提高机体抗肿瘤免疫能力，这一观点被普遍接受。众所周知，低剂量的环磷酰胺具有免疫调节特性，大量的肿瘤动物模型实验显示，应用环磷酰胺去除Treg细胞，可促进效应性T细胞功能的恢复。但有研究证实此法对肿瘤患者的免疫治疗效果欠佳。目前去除Treg细胞的方法包括抗CD25单克隆抗体、咪喹莫特、弗达拉滨、抗-CTLA-4 单克隆抗体、Toll 样受体配体等。Pedroza-Gonzalez等[27]研究表明对于原发性肝癌或结直肠癌肝转移癌患者，应用可溶性GITR配体(GITRL)能在一定程度上阻碍肿瘤浸润Treg细胞的免疫抑制功能。由于CD25、CTLA-4等并非Treg 细胞所特有，因此，去除Treg细胞联合其他免疫治疗(如瘤苗、化疗药物、过继性输入TIL细胞等)也许是最佳的临床选择。Rech等[28]证实联合应用抗CD25单抗和瘤苗可显著、持久地降低转移性乳腺癌患者体内的Treg细胞数目。Duraiswamy等[29]研究显示靶向抑制PD-1/PD-L1信号通路可在增强效应性T细胞功能的同时，抑制Treg细胞功能，并提出联合应用抗PD-1、抗CTLA-4抗体及瘤苗可有效抑制肿瘤，但需进一步的临床试验证实。抗CTLA-4抗体Ipilimumab已于2011年先后被FDA、欧盟委员会批准用于黑色素瘤患者的治疗。PD-1、PD-L1阻断抗体已进入Ⅲ期临床试验。

然而，由于Treg细胞在肿瘤治疗中的作用并非完全明了，Treg细胞的清除也许是把双刃剑。一项研究[30]显示，对于未接受过化疗的结肠癌患者，肿瘤微环境高表达Foxp3+Treg细胞组比低表达组在总生存期及无疾病进展生存期方面，具有显著优势。因此，在抗肿瘤免疫治疗中，是选择清除还是扩增Treg细胞则尤为重要，相关的临床实验在进一步研究中。

总之，肿瘤的发生发展与机体的免疫功能密切相关。Treg细胞可能控制着效应性细胞的活化和增殖，具有抑制免疫应答的作用，与肿瘤免疫逃逸关系密切。有关肿瘤微环境中Treg细胞的水平对肿瘤发生、发展、复发及预后影响的报道不一，其具体作用机制有待于进一步研究。目前去除Treg细胞是抗肿瘤免疫治疗的主要手段，进一步探索Treg细胞对肿瘤免疫功能影响的细胞及分子作用机制，将可能为临床治疗提供新的思路。

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