反刍动物饲料中牛羊源性成分检测污染控制及应对措施

宫玲玲 李俊玲 李会荣 张 芸 强 莉 张 玮（山东省饲料质量检验所 山东 济南 250022）

反刍动物饲料中牛羊源性成分检测污染控制及应对措施

宫玲玲 李俊玲 李会荣 张 芸 强 莉 张 玮（山东省饲料质量检验所 山东 济南 250022）

为打击反刍动物饲料中添加牛羊源性成分的违法行为，切断疯牛病通过饲料的传播途径，防范疯牛病在我国的发生，确保牛羊安全和食品安全，对刍动物饲料进行牛羊源性成分的检测。然而牛羊源性成分检测步骤繁多，检测过程复杂，做好污染控制对检测成败至关重要。根据多年来从事牛羊源性成分检测总结的经验和教训，下面从以下几个方面介绍避免交叉污染的控制措施以及出现污染后的应对措施。

1 反刍动物饲料中牛羊源性成分检测交叉污染的控制

1.1 合理分隔试验区 （1）样品处理区(样品粉碎区和称样区)；（2）核酸提取区；（3）PCR反应液制备区；（4）扩增区；（5）PCR产物鉴定区。其试验用品及取样枪应专用。

1.2 枪头、离心管等消毒灭菌 枪头、离心管、配反应体系所用的水等用前经过高温灭菌，一般120℃ 30min即可。注意不要和微生物共用灭菌锅，以免被培养基中的牛肉膏污染。

1.3 样品的粉碎 用较小的粉碎机粉碎反刍动物饲料，便于清理。粉碎机放置在能排风的环境中。粉碎机先粉碎玉米碴或麸皮4～5遍，再粉碎经4分法分取的样品3遍弃掉，收集第4遍粉碎的全部样品混匀装袋备用。注意粉碎完每一遍都要用气枪、毛刷将粉碎机清理干净。一份样品使用一套工具，包括手套，可使用废弃报纸代替塑料布，用后废弃。

1.4 称样 称样时一个样品用一把勺子，也可用称样纸折成小条代替勺子。称样时戴手套，如样品沾到手套上要及时更换。

1.5 核酸提取 提取液分装成小包装。加提取液时一样一枪头，避免交叉污染。

1.6 PCR反应液制备 在配制过程中，注意加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染，所有的PCR试剂都应小量分装，避免反复冻融影响效果。

1.7 扩增 牛羊源性成分设立阳性和阴性对照。（1）设立牛羊源性成分阳性和阴性对照和试剂对照。阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照；（2）牛羊源性成分阴性对照。包括：①样品对照：被检的样品是饲料就用鉴定后的阴性饲料作对照；②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

1.8 牛羊源性成分PCR产物鉴定 PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。在电泳上样时，扩增后的PCR管盖小心开启。PCR产物鉴定时使用的EB(溴化乙锭)是一种致癌剂，对操作者和环境都有一定的污染。为了操作者的健康和避免对环境造成污染，选用EB替代物，如Goldview等试剂。我们在试验过程中做了多次EB及EB替代物的比对试验，表明二者的染色效果基本相同。

2 反刍动物饲料中牛羊源性成分检测污染后的应对措施

反刍动物饲料中牛羊源性成分检测出现污染后，可能所用耗材、称样、核酸提取、试剂、反应体系等被污染；要从操作环境、样品粉碎、称样、核酸提取、反应体系的制备、扩增、PCR产物鉴定等各个环节逐一排除。（1）操作环境净度不够。环境中存在气溶胶、阳性核酸、阳性PCR产物等。采取措施：桌面用酒精擦试。房间开窗通风一周左右。（2）样品粉碎时污染。用玉米碴、要粉碎的样品多过几次粉碎机，每次粉碎完都用毛刷、气枪清理干净。（3）用酒精擦净称样用的天平，称样时带一次性手套，并及时更换。（4）操作仪器和实验用具消毒不严。耗材、加样枪、容器、双蒸水等严格消毒。离心机的转子、离心孔、内腔用酒精消毒。（5）核酸提取时试剂污染。更换试剂。（6）反应体系污染。更换所有的试剂及引物。（7）扩增时PCR仪污染。用酒精擦拭PCR仪的小孔及盖子。（8）PCR产物鉴定时污染。更换电泳缓冲液、上样缓冲液及Mark等。

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1007-1733(2014)11-0040-01

2014–08–08）