猪繁殖与呼吸综合征基因分型及免疫反应研究进展

刘 兵 （山东省枣庄市畜牧兽医局 277800）

猪繁殖与呼吸系统综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的，1992年被国际兽疫局(OIE)列为需要通报的B类传染病，我国亦将其列为二类传染病。郭宝清等[1]首次在国内分离出PRRSV，从而证实了本病在我国大陆的存在。在随后的几年里，我国很多省份都有本病发生的报道[2]，本病给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。

1 PRRSV基因分型及特点

1.1 基因分型 （1）在同一时期不同地域PRRSV有着不同的遗传株系[3]。PRRSV两种主要的基因型是欧洲型(基因型1)和北美洲型(基因型2)，在核苷酸水平上同源性只有55～80%。两个基因型的毒力、抗原性和基因组却不相同，导致毒株分为两个亚型：A亚型，大多数是美洲型毒株；B亚型，大多数是欧洲型毒株[4]。我国的PRRSV分离株属于美洲型。美洲型毒株至少有3个基因亚型，其中PRRSV的(mlV)弱毒株构成一个亚型；日本和台湾毒株与美洲毒株相似[5]。（2）美洲型PRRSV分离株间有高度的基因变异性，各分离株GP5编码区的核苷酸同源性只有90%甚至更少[6]。欧洲株之间也存在显著的基因异源性，甚至还有更多的异源毒株(同源性72.2%～90%)[3]。许多学者认为，基因型的演变导致了不断增加的株系多样性[7]。（3）最初，认为1型和2型病毒只分别局限在欧洲和北美洲出现，但在欧洲，1996年因为使用弱毒的PRRSV活疫苗而传入了2型PRRSV[8]，大约1999年北美洲对1型PRRSV也有了报道[9]。虽然1型和2型病毒引起的临床症状非常相似，但遗传的高度多样性将会导致病毒重组而产生具有新的生物学特性的不同的病毒；在丹麦出现的PRRSV被证明是由于使用的2型弱毒活疫苗返祖造成的[9]。1型和2型间遗传和免疫原的多样性可以很轻易地通过RT-PCR、单克隆抗体和血清学试验加以区别。（4）Pesch等[10]用66株1991～2001年PRRSV毒株ORF5全序列及3株改良的活疫苗毒株，19种毒株的ORF6、ORF7，推导ORF5的氨基酸序列可变性，并得到可变区及保守区的客观结果；系统发育分析和核苷酸序列比对显示株系间的遗传距离随时间的增加而扩大。

1.2 基因结构 （1）PRRSV以反遗传体系发展，全长15195个核苷酸的病毒基因以单克隆cDNA装配，不分节，且包裹在同质异构的衣壳结构中。病毒基因包含9个开放阅读框架(ORF)，由5′端开始分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b及ORF3～ORF7[9]，其中ORF2b编码的蛋白被证实是一个结构蛋白。ORF1(包括ORF1a和ORF1b)开始于5′端211个核苷酸后，约占整个病毒基因组的80%，由基因组RNA直接表达，为病毒的非结构蛋白(NSP)编码区，ORF1a和ORF1b编码多聚蛋白，这些蛋白可以从引入的RNA直接翻译而来。认为多聚蛋白分成13个非结构蛋白参与基因的复制和翻译[11]。ORF2a至ORF7分别编码结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5(E)、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(N)，这些结构蛋白都是由一个嵌套式的3′端亚基因mRNA翻译而来[12]。PRRSV至少含有7个结构蛋白，即糖蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5(E)、膜基质(m)蛋白、核衣壳(N)蛋白，这些结构蛋白具有紧密的联系，其中E和m以异源二聚体的形式联系[13]。（2）ORF2至ORF7位于基因组3′端，ORF7的终止密码子之后为114个核苷酸的非编码区和约20个核苷酸的多聚腺苷酸尾(PolyA)；并且相邻的ORF有部分重叠。美洲型在ORF4与ORF5间存在10kb的非编码区[14]。据推测，3′端非编码区可能是病毒复制过程中负链RNA开始合成时多聚酶结合的区域。（3）PRRSV通过产生6个亚基因组mRNA来进行表达[15]，这些mRNA具有来自病毒基因组RNA 5′端非编码区的共同前导序列，长度大约200个核苷酸，并且3′末端相同，从而形成一组3′末端嵌套结构。从ORF1到ORF7亚基因RNA呈递减顺序排列，分别为15、3.3、2.7、2.2、1.7、1.1、0.7kb。也有报道说可产生7个亚基因组mRNA，即在ORF3 和ORF4 之间有一个mRNA 3.1[16]。在转录过程中，前导序列连接到每个mRNA中去，产生具有相同5′端前导序列的亚基因组mRNA，然后翻译成病毒蛋白。

2 PRRSV的免疫反应

（1）猪肺血管内巨噬细胞在清除血液内的细菌和其它有害粒子方面具有十分重要的作用。PRRSV最显著的生物学特性是对巨噬细胞(PAm)的亲嗜性，PAm是主要的靶胞，PRRSV主要通过鼻黏膜和呼吸道黏膜上皮进入猪体内，病毒在鼻腔黏膜、呼吸系统的巨噬细胞和淋巴细胞中完成最初的复制，然后通过血液循环到达继发复制部位[17]；在妊娠中后期，还可通过胎盘进入胎儿体内，PRRSV感染后由于在巨噬细胞、单核细胞和小胶质细胞中的某些亚群中复制，主要引起猪的免疫损伤和免疫抑制。体外试验证明，PAm在PRRSV感染48h后死亡[18]，发生细胞病变，易发生混合感染。（2）PRRSV感染后7～9d，血清中一类高水平的抗体应答反应即能被ELISA检测到，这种抗体同样也能被间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层细胞染色(IPmA)检测到。然而，这种感染早期产生的抗体在体外试验中不能中和PRRSV。感染早期抗体，一般在感染21d后采集，用于动物免疫保护试验，证明这些感染早期抗体不能介导被动免疫保护。感染PRRSV的猪迅速产生抗体，但抗体主要是针对N蛋白，没有中和反应，m蛋白只诱导产生低水平的抗体。感染后4周才能产生中和抗体，且产生的浓度也比较低，但抗E蛋白的中和抗体在感染猪体内维持时间比抗N蛋白的抗体要长得多[19]。（3）许多研究都评价了PRRSV感染猪后产生的免疫反应，虽然PRRSV能诱导产生体液和细胞免疫，但病毒在首度感染猪几个月后仍然能够复制[20]。猪不能抵抗PRRSV感染也许跟只表达低水平的IFN-γ有关[21]。IFN-γ属Ⅱ型干扰素，主要由活性的NK细胞和T细胞产生，NK细胞和T细胞分泌的IFN-γ能增强mHCⅠ和mHCⅡ的表达，氮氧化物的产生和APC次氧化物的基本构成。由于它对APC的作用，IFN-γ在增强Th1、产生特异性记忆T细胞抗原和在未感染的细胞和组织产生抗病毒作用方面起着非常重要的作用。体内试验揭示PRRSV 感染的猪能产生少量的IFN-γ，有人认为PRRSV能够抑制IFN-γ的合成；并且证明以重组的猪IFN-γ处理的PAm能抑制PRRSV的复制。PRRSV的持续感染与感染猪对病原产生的免疫反应失效有关。感染PRRSV后，通过对T、B免疫细胞的检测发现CD8+T细胞数量增多，CD4+T减少；有抗体依赖性增强现象[22]，增加感染；心脏巨噬细胞、肺上皮细胞、扁桃体、淋巴细胞、胸腺和脾的树突状细胞等也受到一定程度的影响。（4）Chang等[23]观察猪普通病原体PCV2和PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞感染效果，结果PCV2感染组含抗原率高但没有细胞死亡，有高水平的IFN-α产生；PRRSV感染组有明显的细胞死亡；阴性对照组和PRRSV感染组没有IFN-α产生。

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