TGF－β介导的上皮－间质转化与恶性肿瘤转移的相关性研究进展＊

于伟娜，罗军敏，冯继红

上皮－间质转化（epithelium－mesenchymal transition，EMT）是一个连续的生物学过程，可促进上皮细胞表型发生变化，以获得间充质细胞的表型特征［1］；EMT在恶性肿瘤转移过程中起到了关键的作用，在此过程中，肿瘤细胞获得了一定的迁移和侵袭能力，这也是肿瘤发生转移的前提和基础。转化生长因子－β（TGF－β）作为一个多功能的细胞因子，在EMT的诱导及肿瘤细胞的侵袭转移中起到关键作用。研究发现TGF－β可通过多种信号通路及转录因子调控EMT的发生，从而促进肿瘤的浸润转移。本文将综述TGF－β诱导的上皮－间质转化在恶性肿瘤转移中的作用及相关调控机制，以期为肿瘤治疗提供新的思路。

1 EMT转化过程及特征

EMT主要是指上皮细胞间黏附下调，极性消失，上皮标志蛋白表达降低，获得具有减少细胞间相互作用并增加细胞迁移能力及侵袭性的间质细胞表型的一种转分化过程。上皮细胞与其周围的上皮细胞通过黏附连接、细胞桥粒、紧密连接和缝隙连接形成的细胞间连接在很大程度上是不变的。相反，间质细胞并不会形成广泛的细胞间连接，而是呈现出一种前后极化的状态，参与细胞骨架重建和基因表达的重新编程，可作为单个个体在细胞外基质中穿行［2］。EMT不论在肿瘤的形成（Ⅲ型EMT），还是在胚胎和器官发育（Ⅰ型EMT）以及在慢性炎症、创伤修复和组织纤维化（Ⅱ型EMT）中都起着至关重要的作用［3］。

EMT的转化过程是以细胞形态、紧密／黏附连接变化以及E－钙黏蛋白、紧密连接蛋白－1（ZO－1）和其他分子表达下降为基础的。细胞在经历EMT的过程中，通过上调和下调紧密黏附连接蛋白，使上皮细胞间的黏附连接复合物降解同时顶端－底外侧细胞极性消失，蛋白酶激活使基底膜裂解，肌动蛋白细胞骨架重组，应力纤维形成从而使细胞获得了向远处侵袭转移的能力。另外，有学者在转移位点发现MET现象，认为可能是通过重建上皮细胞间的连接实现的，这一结果表明 EMT 是一个瞬态和可逆的过程［4，5］。

在EMT的过程中，E－钙黏蛋白丢失是最早产生的步骤之一，标志着一系列信号事件和重大骨架重组的启动［6］。EMT的一个关键的特征是从E－钙黏蛋白到N－钙黏蛋白表达的变化，细胞在经过EMT之后，E－钙黏蛋白的表达下调伴随着N－钙黏蛋白的表达增加，促进了内皮细胞与基质成分的相互作用，使细胞的能动性和侵袭性进一步增加，从而促进肿瘤的进展［7］。E－钙黏蛋白介导黏附的丢失被认为是肿瘤细胞侵袭和转移的一个先决条件，可促进肿瘤细胞从原发灶脱离并促使其在转移部位定居。细胞内E－钙黏蛋白结合于 β－连环蛋白（β－catenin）、α－连环蛋白（α－catenin）和p120－连环蛋白，皆参与介导细胞内信号并组成细胞之间的黏附连接，以维持上皮细胞的特性［8］。当E－钙黏蛋白表达受抑制后，细胞黏附连接解体并释放其结合伴侣β－catenin进入细胞质，随后β－catenin移位进入细胞核并与转录因子淋巴增强结合因子（lymphoid enhancer binding factor，LEF）结合形成β－catenin／LEF复合体，启动其依赖的转录过程而发生 EMT［9］。

2 TGF－β与EMT关系

TGF－β是一个多功能的细胞因子，能够调节各种各样的生物学过程，包括细胞生长、分化、凋亡、免疫、细胞外基质（ECM）的产生、血管生成、迁移和侵袭等。TGF－β与激活素、骨形态发生蛋白（BMPs）共同构成TGF－β超家族的成员，TGF－β亚家族成员在脊椎动物胚胎发育EMT中发挥着重要的作用。TGF－β能介导EMT发生的现象首先在细胞培养中发现。经TGF－β的作用，上皮细胞从立方形变为狭长的纺锤体形，同时上皮标志物表达下降，间质标志物如纤连蛋白和波形蛋白表达增强，细胞流动性亦随之增加。Graauw等在对基底样浸润性乳腺癌的研究中发现，膜联蛋白A1呈高表达状态。膜联蛋白A1作为TGF－β信号的阳性调节剂，促进EMT及侵袭转移性能；而用siRNA下调膜联蛋白A1的表达则能阻止其转移［10］。

TGF－β诱导的EMT是一个高度复杂的过程，可通过Smad／non－Smad分子依赖信号转导途径发挥作用引起EMT发生。Smad信号通路是TGF－β诱导EMT形成的主要机制。TGF－β 的三个亚型（TGF－β1，TGF－β2，TGF－β3）通过结合其跨膜丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶Ⅱ型受体（TβRII）来激活信号通路，转导TGF－β超家族成员的信号，随后使TGF－βⅠ型受体（TβRⅠ）转磷酸化。TGF－β诱导的受体复合体的激活使受体调节的Smad蛋白（R－Smads）、Smad2 和 Smad3发生磷酸化并使其激活，激活的R－Smads与Smad4形成复合物，并转移到细胞核中与其他转录因子相互作用共同激活或抑制目的基因的转录，形成TGF－β 诱导的EMT的转录调节剂［11］。另外，R－Smads与Smad4所形成的三聚体能够强化诱导Snail的转录，随后抑制EMT的特征性标志E－钙粘蛋白的表达［12］。

除了Smad通路外，TGF－β信号转导还存在其他的信号通路—non－Smad通路，其主要包括GTPase信号通路、PI3K／AKT通路、RhoA 和 MAPK 通路等［13］。TGF－β 诱导癌细胞可以通过激活PI3K／AKT信号系统增强肿瘤细胞的幸存、转移，介导EMT的产生。同时作为蛋白激酶MAPK家族成员的ERK1／2、JNKs、p38MAPKs在 TGF－β 介导的 EMT 及肿瘤细胞的转移中均具有重要的意义。JNK信号的失活将阻止TGF－β刺激诱导上皮细胞EMT所产生的形态学及转录调节的变化。另外，Par6 能与 TGF－β 受体相互作用［14］，在 TGF－β信号的刺激下，TGF－βⅡ型受体使Par6发生磷酸化，导致降解RhoA的泛素连接酶Smurf1的聚集，从而使GTPase RhoA蛋白酶体的降解，促进EMT的形成。

3 TGF－β诱导EMT的分子调控机制

3．1 转录调节

3．1．1 Snail转录因子家族 现已发现越来越多的分子参与EMT的过程，锌指转录因子Snail作为它们中的一员，在靶向EMT的过程中发挥着主要的角色。Snail的异常表达抑制E－钙黏蛋白的表达，导致产生一个完整的EMT表型，而沉默Snail的表达则能逆转这一过程［15］。Saito 等［16］发现在 TGF－β1诱导的人鳞状细胞癌HSC－4中，蛋白组学揭示Slug表达上调的同时整合素α3β1表达也同样上调，而经RNA干扰Slug的表达则能显著抑制间质细胞标志的表达和HSC－4肿瘤细胞的迁移；研究还发现抗整合素α3β1抗体能显著抑制TGF－β1诱导的细胞迁移，这些结果显示Slug在TGF－β1诱导的EMT及整合素α3β1介导的迁移中均占有着重要的角色。

3．1．2 转录因子 Twist蛋白 碱性螺旋－环－螺旋转录因子Twist的过表达或其启动子的甲基化在癌肿转移中也非常常见。活化的Twist能上调N－钙黏蛋白并下调E－钙黏蛋白的表达，对EMT的发展及肿瘤的转移均有促进作用。有学者在前列腺癌的研究中发现沉默STAT3或HIF－1α均能有效降低TGF－β1诱导的Twist1的表达，除此之外，STAT3也能通过HIF－1α的稳定表达增强TGF－β1诱导的Twist1的表达，为前列腺癌细胞的迁移和侵袭提供必要条件［17］。da Silva等报道在口腔鳞状细胞癌的进展期阶段，Twist1的表达明显增高，且临床观察发现Twist1表达上调是对淋巴结和肺转移以及不良预后评估的可靠指标［18］。因此，了解Twist在促进EMT以及肿瘤转移中的作用，可为新的抗癌药物的研发提供新的方向。

3．1．3 核转录因子－κB（nuclear factor kappa B， NF－κB） NF－κB是免疫和炎症反应的一个关键调节因子，同时在EMT的过程中也发挥着重要的作用。在正常上皮细胞TGF－β抑制NF－κB的活性，但在恶性肿瘤细胞中则可以激活这一转录因子［19］。Kumar等［20］报道 TGF－β 诱导非小细胞肺癌细胞株发生EMT后，EMT相关转录因子 Twist1、Snail、ZEB2表达显著提高，且NF－κB的活性也明显增加。进一步研究发现通过抑制NF－κB的活性导致转录因子Twist1、Snail、ZEB2的表达缺失且癌细胞的侵袭转移性能降低，这一结果表明NF－κB在EMT及肿瘤的侵袭转移中具有重要的角色。另有研究发现抑制NF－κB信号的活性能阻止EMT的发展，且能够引起EMT的逆转，而激活这一通路则能够促进肿瘤细胞向间质细胞表型转化，表明NF－κB是诱导和维持EMT所不可缺少的［21］。

3．2 信号转导通路

3．2．1 Wnt通路 Wnt通路在肿瘤的进展及与之相关的EMT中有着重要的意义。在浸润性乳腺癌模型中，典型的Wnt信号通路参与β－连环蛋白从胞质到胞核的转移，从而促进肿瘤的进展［22］。另外，TGF－β信号可诱导Snail的表达，而Wnt信号可使Snail的表达更加稳定，且Smads能够结合于淋巴增强因子 1（LEF1）和 Snail［23］。因此，在 Wnt和 TGF－β诱导的EMT过程中，共同的Smad－LEF－Snail复合物的形成可能促进EMT的产生。

除了典型的Wnt信号，TGF－β能够诱导并与非典型的Wnt信号协作形成一个信号通路网络促进乳腺癌细胞EMT的产生。TGF－β／活化素和Wnt配体的胞外拮抗剂的调节性分泌可以使乳腺癌细胞保持上皮细胞表型而免于受自分泌产生的TGF－β或Wnt信号的刺激。当EMT发生时，这些配体呈高水平表达，致使胞外拮抗剂表达下调，导致对TGF－β和Wnt的持续自分泌反应，促进肿瘤细胞向间质细胞转换［24］。

3．2．2 Notch通路 现已证明Notch通路在心瓣膜等器官发育及肿瘤形成过程中促进EMT的产生。Luna－Zurita提出Notch和TGF－β与 BMP2协同作用共同参与心内膜组织Endo－MT 的诱导［25］。BMP2 类似于 Wnt，抑制 GSK3β 的活性，从而使Snail处于稳定状态。Snail驱使的EMT不但需要TGF－β信号的转录诱导，还需要Wnt或BMP信号蛋白的稳定性。Nyhan等研究表明在人肾脏上皮细胞EMT模型中，TGF－β信号通过Smads通路诱导Jagged1等一些 Notch受体配体的表达。随后Jagged1诱导Notch通路的旁分泌信号，有效的使上皮细胞周期阻滞，并最终导致EMT的发生［26］。

此外，在经历了EMT的肺上皮细胞和肌成纤维细胞分化中同样发现Notch信号诱导TGF－β的分泌［27］。肌成纤维细胞分化的重要标志—α－平滑肌肌动蛋白在肺上皮细胞诱导产生，并以TGF－β和Smad3依赖的方式对Notch信号的激活产生应答，与此同时Jagged1配体也被诱导产生，以利于形成对Notch通路的持续激活。

4 TGF－β介导的EMT与肿瘤转移

转移是癌细胞区别于正常细胞的最基本特征，这也是肿瘤进展过程中所必须的。肿瘤转移包括多个步骤，其中侵袭是肿瘤转移的前提，肿瘤细胞间粘附减弱和肿瘤细胞运动增强是侵袭的基础。TGF－β参与各种类型癌肿转移过程，目前证据支持EMT可提高癌细胞的侵袭性并内渗到淋巴或血管，这可作为细胞转移的早期表现之一。在癌组织中，肿瘤上皮细胞在经历EMT后变得更具有侵袭性，且实验证实在一些肿瘤细胞的转移灶内有EMT标志的存在，分述如下。

4．1 胃癌 TGF－β1通过下调E－钙黏蛋白并上调波形蛋白的表达诱导胃癌细胞产生EMT，而抑制TGF－β1下游转录因子KLF8的表达则能有效的降低胃癌细胞的迁移、侵袭、运动能力，这可为胃癌的治疗提供一定的理论基础［28］。Liu等［29］检测61例胃癌组织和邻近正常组织中Twist、E－钙黏蛋白以及波形蛋白的表达情况，结果显示胃癌组织Twist、E－钙黏蛋白以及波形蛋白阳性率分别为 73．9%、40．6%和 60．9%，而邻近正常组织表达则分别为 2．9%、75．4%和 27．5%； 另外通过在细胞层面上干扰Twist的表达，发现Twist表达明显减少的同时，E－钙黏蛋白的表达却显著增加，且癌细胞的侵袭性能也显著受抑，表明Twist在EMT以及胃癌的进展中发挥着重要作用。

4．2 结直肠癌 Fan等报道结肠癌细胞Snail的过表达能够诱导EMT的产生并增加细胞的迁移、侵袭转移能力和化学抗性，表明Snail的表达增加与结肠癌的进展有关［30］。另有学者应用免疫组化方法对251例结肠癌组织样本检测发现，76%的样本中发现Snail1的表达，87%的样本中E－钙黏蛋白表达明显丢失，且Snail1表达阳性的结肠癌组织与淋巴结转移成正相关［31］。Pohl等在对结肠癌SW480细胞的研究发现，SMAD4通过下调内源性 TGF－β亚型来抑制 TGF－β诱导的EMT。SMAD4＋的SW480细胞TGF－β亚型表达水平减少，导致TGF－β信号下降，从而抑制其侵袭性，实现EMT的逆转［32］。

4．3 肺癌 转移是导致肺癌患者病死的主要原因之一，研究显示EMT在肺癌转移过程中发挥着关键作用。SPOCK1作为TGF－β的下游靶向基因，能够增强TGF－β1诱导的肺癌细胞的 EMT 现象，促进肺癌的进展及转移［33］。Chen 等［34］报道 TGF－β1通过 PI3K／Akt和 MAPK／Erk1／2信号通路诱导肺癌细胞发生EMT，增加其侵袭和转移性。

4．4 乳腺癌 近期研究发现乳腺癌中高水平的TGF－β1可能与不良的预后有关，且抑制TGF－β信号则能够降低乳腺癌的转移，因此靶向TGF－β1或TGF－β信号可以为转移性乳腺癌患者治疗提供新的思路。Lv等用TGF－β1诱导乳腺癌细胞发现，细胞形态发生明显变化且伴随着上皮标记的减少和间叶质标志的增加，同时细胞侵袭能力也进一步增强，且干扰 Smad2的表达则能抑制这些现象的发生［35］。Karihtala等［36］通过免疫组化检测发现乳腺癌组织波形蛋白、EMT相关转录因子Zeb1和Sip1的表达明显增加，且与肿瘤细胞的不良分化、临床分期以及淋巴血管侵袭有关，说明它们与乳腺癌的进展密切相关，可作为临床治疗的潜在靶点。

4．5 卵巢癌 Jin等在对卵巢癌的研究中提到Snail与基质金属蛋白酶（MMPs）相互作用促进卵巢癌的侵袭和转移，且免疫组化分析显示Snail在转移灶表达明显增加并与癌症的分期有关［37］。Mao 等［38］研究发现用 EMT 调节因子 Twist2 处理卵巢癌SKOV－3细胞，可以诱导下调E－钙黏蛋白，上调N－钙黏蛋白和β－连环蛋白等EMT相关表型的表达，表明Twist2可以通过抑制E－钙黏蛋白的表达增加β－连环蛋白的释放从而促进卵巢癌细胞的侵袭和远处转移。

4．6 其他 在侵袭性骨髓瘤的研究中，骨髓衍生的抑制细胞与肿瘤细胞分泌的趋化因子CXCL5作用，浸润肿瘤细胞并分泌TGF－β、EGF、HGF等多种生长因子，最终诱导肿瘤细胞发生EMT［39］。Sun等在对97例肝细胞癌患者研究中发现Bcl－2／Twist1复合物的形成能加速Twist1的核转录，从而增加肿瘤细胞的可塑性、转移及血管生成能力，最终与这些肝癌患者的不良预后有关［40］。Gong等指出Twist的核表达与食管鳞状细胞癌的淋巴结转移密切相关［41］。

另外，除了EMT对肿瘤细胞的直接作用外，历经EMT的肿瘤细胞分泌许多生长因子和趋化因子刺激并募集基质细胞，加速肿瘤细胞的迁移和侵袭。有研究发现黑素瘤细胞衍生的IL－8通过自分泌活动促进肿瘤细胞的增值和迁移，而经由旁分泌则可促进内皮细胞血管生成并向肿瘤部位募集中性粒细胞，促进肿瘤的进展［42］。

总之，EMT及其诱导的关键因素TGF－β在肿瘤侵袭转移过程中起重要作用，可能是启动恶性肿瘤侵袭转移的关键所在。对EMT和TGF－β的深入研究不仅有助于更好地理解EMT的发生机制及调节因素在肿瘤生长、转移中的作用，还可为预防及抑制肿瘤侵袭转移提供一个新的治疗策略。目前出现的抑制TβRⅠ激酶活性的小分子抑制剂和针对TGF－β的单克隆抗体等TGF－β拮抗剂，可通过多种机制抑制肿瘤的转移。因此，通过TGF－β拮抗剂抑制EMT的产生可能是阻止肿瘤转移的一个重要机制。

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