聚山梨酯80的分析方法研究进展

张 勇，赵 鑫，贾卫茹

0 引言

聚山梨酯80是一种稳定的非离子型表面活性剂、乳化剂、增溶剂、润湿剂、分散剂和助悬剂，在医药领域中广泛使用[1-10]。由于聚山梨酯具有较强的亲水性和化学上的不解离性，对亲脂性药物有较好的助溶作用，能与许多中药成分配伍，因此在中药注射剂中，常添加聚山梨酯80以增加有效成分的溶解度。其增溶效果好、乳化能力强，药物不易析出，在水包油(O/W)型乳化剂中，能使其他物质在溶液中均匀分散，形成稳定的乳剂。

近年来，聚山梨酯80的安全性愈发受到关注[11-12]。研究发现高浓度时其具有一定的溶血性，且溶血性受产品合成工艺影响，不同工艺及纯化工艺制得的产品差异很大，优质产品在正常使用量不会产生溶血作用[13-15]。对犬进行的药理研究发现，其具有促进组胺释放的作用,聚山梨酯80的类过敏反应有明显的种属差异，犬对其过敏反应比较敏感，猴对其过敏反应不太敏感，食蟹猴后肢静脉注射5%的聚山梨酯80注射液(剂量为50 mg/kg)，进口和国产的聚山梨酯80都未发现有过敏反应[16-21]。

聚山梨酯80是由油酸山梨坦和环氧乙烷聚合而成的。其结构中存在3个支链，每个支链中聚乙氧基(-CH2CH2O-)的数量不同，但整个分子中聚乙氧基(-CH2CH2O-)的数量为20，使其性质存在差别，但其分子量恒定。结构中含有油酸，可以水解产生油酸。分子中不存在共轭双键，故仅有末端的紫外吸收。

由于聚山梨酯80自身的组成成分比较复杂[22-23]，其安全性与用量成为影响药品安全性的关键，药品标准中未形成其检验方法，使得其检验方法成为关键,尤其在制剂及体内的检验方法成为研究的重点，本文对国内外聚山梨酯80的检验方法经行了总结。

1 聚山梨酯80的鉴别

利用聚乙氧基能够与硫氰酸钴铵形成蓝色聚合物，该聚合物能够溶解于氯仿，使氯仿层显色的原理测定。闫位娟等[24]研究了中药注射液中聚山梨酯80的鉴别方法，对42种常见注射液进行研究，采用供试液加硫氰酸钴铵溶液2 mL，摇匀，加1 mL氯仿摇匀，静置1.5 h，观察氯仿层颜色。由于中药注射液中成分复杂，会有干扰。氯仿层出现蓝色为阳性，浅蓝色为弱阳性，绿色为可疑，其他颜色均记为阴性。

2 聚山梨酯80的定量

2.1 分光光度法 闫位娟等[24-25]利用聚山梨酯80与硫氰酸钴铵反应显色原理，采用分光光度法测定其含量。取聚山梨酯80 制成系列浓度的对照溶液，显色，测定吸光度，建立标准曲线，供试品与硫氰酸钴铵溶液显色后，测定。当硫氰酸钴铵用量足够时，供试品溶液吸光度不会随硫氰酸钴铵用量增加而改变。样品显色后，吸光度稳定，由于中药注射液中其他成分影响，测定波长会有差异。刘燕梅等[26]采用本方法测定了4家企业的12批鱼腥草注射液及8家企业的香丹注射液，能够准确测定其中的聚山梨酯80的含量。

2.2 水解法 根据聚山梨酯80结构特点，其结构中含有油酸，利用在碱性条件下水解的方法，水解出油酸，聚山梨酯80与水解产物油酸的比例为1∶1。利用高效液相色谱法测定水解产生的油酸，计算出聚山梨酯80的含量。Michael等[27-28]取生物样品300 μL，加入300 mmol/L的氢氧化钠溶液300 μL，60 ℃放置18 h，进行水解。冷却至室温，加5 mol/L的氢氧化钠溶液150 μL和乙腈600 μL，5 mol/L的氢氧化钠溶液用来使乙腈-水溶液分层。取乙腈层200 μL，加入20 mmol/L磷酸钾50 μL作为供试品溶液。同法制备对照品溶液。色谱条件为ODS柱(3.9 mm×150 mm，5 μm)，流动相为乙腈-20 mmol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至2.8)，检测波长为195 nm，流速1 mL/min。该方法使水解后产生的油酸萃取至乙腈层，消除了蛋白对测定的影响，在蛋白浓度高至75 mg/mL仍可准确定量。

李建伟等[29]取复方苦参注射液样品2 mL，放入烘箱中烘干后(105 ℃，2～3 h)，依次加入2%(w/v)氢氧化钠甲醇溶液2 mL，水浴回流30 min，14%(w/v)三氟化硼-甲醇溶液2 mL，水浴回流30 min，正庚烷5 mL回流5 min，放冷，加饱和氯化钠溶液10.0 mL，振摇15 s，移取正庚烷层(上层)，水洗，加适量无水硫酸钠脱水，得供试品溶液，用气相色谱法测定聚山梨酯80的含量。

2.3 液相色谱-质谱连用法 Baker等[30-31]采用液质联用色谱法测定血样中聚山梨酯80，样品经纯化后，色谱分离，质谱检测。方法是取1 mL样品于装有7 mL乙腈-正丁基氯(1∶4)的培养管(16×125 mm)中，加入紫杉醇甲醇溶液10 μL(0.01 mM)作为内标。涡旋混合10 s，震荡5 min。室温离心10 min，取上层有机相转移至硼硅酸盐玻璃培养管(13×100 mm)，在60 ℃氮气吹干，残渣加甲醇-水(1∶1)100 μL，涡旋10 s，超声5 min，再离心8 min，取10 μL注入液相色谱仪。色谱条件为ODS柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)，柱温40 ℃，流动相为甲醇-水(9∶1)(加0.1%甲酸)，流速0.15 mL/min，质谱采用正离子模式，碰撞能量35 eV，锥孔电压38 V，聚山梨酯80在一级质谱母离子m/z为1 309.8，子离子m/z为419.4；内标物紫杉醇在一级质谱母离子m/z为854.9，子离子m/z为419.4。碰撞气为氩气，压力为0.002 7 mBar，每个通道的驻留时间为0.3 s。

2.4 液相色谱-蒸发光散色检测器法 蒸发光散色检测器能检测不含发色团的化合物，为质量型检测器。Lakshmy等[32]采用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，Alltech ELSD2000型检测器，漂移管温度40 ℃，氮气流速1.5 L/min，流动相为甲醇-水，采用梯度洗脱方式，0～4 min，甲醇30%～90%；4～12 min，甲醇90%～30%。流速1.0 mL/min。该条件下，样品不需要前处理，可以直接进样，聚山梨酯80表现为单峰，保留时间短。

吴晓燕等[33]采用GF250 柱(250 mm×9.4 mm，4 μm)，柱温:30 ℃，流动相为20 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈(90∶10)，流速0.6 mL/min，漂移管温度110 ℃，空气流速2.3 L/min。进行了79批样品的检验，方法准确可靠。

Vikram等[34]采用Waters生产的Oasis HLB固相提取小柱先对样品进行净化，然后采用液相色谱仪进行测定。固相提取小柱用1 mL乙腈洗2次，用1 mL水洗1次，加样品1 mL，抽干溶液，用1 mL水洗脱2次，洗脱液收集至一个新的小柱上，加0.5 mL乙腈，抽干，尽可能收集洗脱液作为供试品溶液。采用ODS-3(C18)(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，0～5 min，乙腈为0%；5～6 min，乙腈为0%～60%；6～8 min，乙腈为60%～80%，并保持5 min；随后乙腈为0%至平衡。该方法的色谱图中聚山梨酯80的峰型好，分析时间合适。

2.5 凝胶色谱-蒸发光散射检测器法 凝胶色谱法又称分子排阻色谱法，是根据分子大小进行分离，有利于聚山梨酯80这种大分子与其他药物分离。尹利辉等[35]采用凝胶色谱柱(8.7×30.0 cm)，柱温30 ℃，流动相为0.02 mol/L醋酸铵溶液-乙腈(90∶10)，流速0.6 mL/min，Alltech ELSD2000ES型检测器，漂移管温度110 ℃，氮气流速2.3 L/min。测定了19种78批中药注射液样品，聚山梨酯80与其他物质分离良好。对6种中药注射液进行回收率实验，回收率在93.8%～99.2%之间。李樱红等[36]测定79批冠心宁注射液中聚山梨酯80的含量，吴毅等[37]测定鱼腥草注射液、新鱼腥草钠注射液、柴胡注射液中聚山梨酯80的含量，唐登峰等[38]测定8家企业30批莪术油注射液中聚山梨酯80的含量，高文分等[39]测定醒脑静注射液中聚山梨酯80的含量，董媛等[40]测定了247批次血塞通注射液和141批次灯盏花素注射液，曹静等[41]测定生脉注射液中聚山梨酯80含量，赵辉等[42]测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量，证明方法准确可靠。

3 展望

3.1 国产聚山梨酯80现状 美国FDA批准的用量显示，静脉注射的给药途径时，注射液中吐温80最大允许用量为10%，冻干粉中吐温80可以加至制剂总重量的12%。可见聚山梨酯80在国外被认为高安全性的药用辅料。这是基于国外聚山梨酯80的产品质量高，性能安全稳定的前提下。我国的聚山梨酯80产品质量参差不齐，不同时期的产品质量差异很大，与进口产品质量相比仍有较大差距[43]。郭志鑫等[44]对10家生产企业的21个批次产品进行质量分析，注射剂厂家提供的吐温80，均是在2010年版药典执行前生产，按照2005年版药典检测，有一批不合格，不合格项目为粘度和酸值，总体不合格率为5%。但是按照2010年版药典，不合格的批数已经上升到62%，其不合格项为环氧乙烷和过氧化值，不合格率分别为38%和57%。孙会敏等[45]对全国5个省市7家企业的18批吐温80进行质量分析，按照2005年版药典全部产品都合格，但是按照2010年版药典检测，总体不合格率升高至62%。在对现有产品双氧水检查中发现，7家企业的产品中均检测出残留，双氧水含量高的吐温80静脉注射后，Beagle犬类过敏反应也高。现实情况是我国制药企业大量采购进口的注射级聚山梨酯80来满足生产需求。

3.2 检验方法选择 聚山梨酯80作为增溶剂、乳化剂在注射液中使用广泛，使许多水溶性差的药物具有广阔的开发前景。随着人们对于药用辅料的研究深入，其安全性备受关注。使其在药品中的用量成为检测的重点。迫切需要一种简便，准确的方法测定其含量。随着检测技术的不断提高，根据样品的特点，选择合适的检测方法测定其含量成为现实。制剂中的聚山梨酯80建议采用凝胶色谱-蒸发光散射检测器法，该方法经过多种制剂检验验证，方法准确可靠，便于操作。由于聚山梨酯80分子量为1 309.8，具有长链结构，属于大分子，药物分子一般都属于小分子，易于分离。通过凝胶色谱分离，能够控制产品分子量分布，分子量分布范围低的产品质量更加可靠，安全性高[44]。对于生物样品，可以采用固相萃取法或液-液萃取法去除蛋白质，再经过色谱分离，然后再利用质谱的高灵敏度进行检测。质谱具有高分辨率，能够将不同质荷比的物质分别测量，同时测量多种物质，定性定量准确。

3.3 质量控制要点 在提高聚山梨酯80的含量的同时，更应将质量控制的重点放在相关的杂质检测上，聚山梨酯80本身虽然具有一定的药理活性，但是其本身的活性不及杂质的活性，杂质的活性是其产生不良反应的主要原因，应重点进行监控，对于购入的聚山梨酯80辅料，应严格按照现行药典标准进行检验，并增加脂肪酸组成检查[46-47],双氧水检查[48-50]及残留溶剂检查[51]，脂肪酸复杂的产品一般是由于使用的原料油酸纯度不够高，为了使产品颜色符合规定，需要添加双氧水除色，造成双氧水残留。在进行制剂生产前严格控制其质量，以降低不良反应发生的概率，将用药风险控制在生产前。

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