HPLC法同时测定复方甘草片中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸

赵月然， 卢 丹

(大连市食品药品检验所，辽宁 大连 116021)

复方甘草片[1]是临床应用较广的祛痰镇咳药，疗效确切且经济实惠。其以甘草浸膏为主药，甘草浸膏可以覆盖在发炎咽喉黏膜上， 掩盖局部感觉神经末梢， 从而减少刺激，发挥止咳效应[2-3]。甘草据文献报道[4-11]，甘草具有润肺，解毒，调和诸药的作用。甘草中的甘草酸和甘草黄酮是生物活性较强的物质，现代药理学研究表明甘草酸为皂苷类，在甘草中含有量较高，超过2%，其具有较强的保肝活性和肾上腺皮质激素样作用，可增强内耳听觉，能够抗炎、抗变态反应、解毒止咳、抗肿瘤、影响脂质代谢等作用。甘草中的甘草苷、异甘草苷、甘草素是甘草中重要的黄酮类化合物，具有抗溃疡、抗菌、抗炎、解痉、镇痛等作用。

《中国药典》2010年版二部收载了复方甘草片中甘草酸定量测定，刘晓娜等[12]测定了复方甘草片中甘草酸、异甘草苷和异甘草素的量，杨红娟等[13]同时测定了复方甘草片中吗啡、磷酸可待因、甘草苷和甘草酸的量。本实验采用超声提取及高效液相色谱法同时测定复方甘草片中甘草酸、甘草苷、甘草素及异甘草苷的量，该方法简单、准确、重复性好，为复方甘草片的质量控制提供了有益的参考意见。

1 仪器与试药

Agilent-1260型高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、在线脱气机、DAD检测器；AS3120A超声提取器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；BP211D型、BP221S型电子分析天平(德国Sartorius公司)。

甘草苷对照品(批号111610-200604)，甘草酸单铵盐对照品(批号110731-200614,98%)均购于中国药品生物制品检定所；甘草素对照品(批号20100603)购于天津一方科技有限公司；异甘草苷对照品(批号20101108)购于上海永恒生物科技有限公司。复方甘草片3批(东北制药集团沈阳第一制药有限公司;批号 110911、111012、111113)。乙腈、甲醇为色谱纯(美国MREDA公司)，

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Dikma Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脱(0～10 min，15%～25% A；10～20 min，25%～32% A；20～24 min，32%～34% A；24～30 min，34%～36% A；30～32 min，36%～42% A； 32～43 min，42%～51% A)；检测波长为276 nm(0～16 min)、360 nm(16～24 min)、276 nm(24～28 min)、254 nm(28～38 min)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.甘草苷 2.异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸

2.2 对照品溶液的配制 精密称取甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸对照品适量，分别加甲醇溶解，制成质量浓度分别为1.084 0 mg/mL、0.198 1 mg/mL、0.100 0 mg/mL、1.714 mg/mL的对照品贮备液，备用。分别加甲醇溶解，制成每1 mL分别含甘草苷54.20 μg、异甘草苷9.90 μg、甘草素10.00 μg、甘草酸171.4 μg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取复方甘草片20片，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL(含1%氨水)，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇(含1%氨水)补足损失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察 分别精密量取“2.2”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1 甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸回归方程

2.5 精密度试验 取复方甘草片粉末约0.5 g，精密称定。按“2.3”项下供试品溶液制备的方法操作，在上述色谱条件下连续进样6次，测得甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸的RSD值分别为1.6%、2.0%、2.2%、2.6%。结果表明,仪器精密度较好。

2.6 重复性试验 取复方甘草片粉末6份，每份粉末约0.5 g，精密称定。按“2.3”项下供试品溶液制备的方法操作，在上述色谱条件下进样，测得甘草苷平均含有量为3.53 mg/g(RSD=1.1%)、异甘草苷平均含有量为1.56 mg/g(RSD=2.4%)、甘草素平均含有量为0.38 mg/g(RSD=2.9%)、甘草酸平均含有量为8.37 mg/g(RSD=1.2%)。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，在室温下放置，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，测定峰面积。甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸峰面积的RSD分别为1.3%、1.6%、1.9%、1.7%。结果表明，4种化合物在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 称取已知含有量的复方甘草片(111012)6份(甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸的量分别为3.53、1.56、0.38、8.37 mg/g)，每份约0.25 g，精密称定。分别准确加入甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸对照品贮备液0.80、2.00、1.00、1.20 mL。按“2.3”项下供试品溶液制备的方法操作，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率。结果见表2～5。

表2 甘草苷加样回收率试验结果(n=6)

表3 异甘草苷加样回收率试验结果(n=6)

表4 甘草素加样回收率试验结果(n=6)

表5 甘草酸加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品测定 取复方甘草片粉末3批，按“2.3”项下的方法操作，在上述色谱条件下进样测定并计算样品中4种成分的量，结果见表6。

表6 样品测定结果(n=3)

3 讨论

依据文献[14-17]，本实验分别考查了乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液四个流动相系统,结果表明采用乙腈-0.05%磷酸为流动相所得到的色谱图4种化合物的分离效果好，干扰较小。故选用乙腈-0.05%磷酸为流动相系统。

提取条件分别考察了超声、回流，结果表明，超声30 min提取效果最好。提取溶剂分别考察了50%甲醇、70%乙醇和氨性乙醇，结果表明，氨性乙醇提取4个化合物的效果最好。

本实验建立的 HPLC法可以同时测定复方甘草片中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸的量，此法专属性好，灵敏度高，操作简便，结果准确可靠，适用于复方甘草片中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸的质量控制,可作为质量控制的定量方法。

参考文献：

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2010年版二部[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：575-576.

[2] 孙国祥，智雪枝．用HPLC指纹图谱对复方甘草片实施全质量控制研究[J]．中南药学，2008，6(3): 349-355.

[3] 梁 冰, 杨爱馥, 黄凤兰，等.甘草属( Glycyrrhiza) 化学成分及药理作用研究进展[J]. 东北农业大学学报，37(1):115-119.

[4] 邢国秀, 李 楠, 王 童，等.甘草中黄酮类化学成分的研究进展[J].中国中药杂志，2003，28(7):593-597.

[5] 高雪岩，王文全，魏胜利，等.甘草及其活性成分的药理活性研究进展[J].中国中药杂志，2009,34(21):2695-2700.

[6] 许秋霞,邹 敏.甘草的药理作用概述[J]. 实用中医药杂志，2005，21(7):450-451.

[7] 田庆来,官月平,张 波.甘草有效成分的药理作用研究进展[J]. 天然产物研究与开发，2006,18(2): 343-347.

[8] 季宇彬,姜 薇,范玉玲.甘草黄酮的研究进展[J].中草药，2004，35(9):5-6.

[9] 南京中医药大学.中药大辞典[M].2版.上海：上海科学技术出版社，2006:788.

[10] 李 薇，宋新波，张丽娟， 等．甘草中化学成分研究进展[J]．辽宁中医药大学学报，2012，14(7):40-42.

[11] 李 妍，杨燕云，张振秋，等.HPLC法同时测定白芍、甘草药对提取物中9种有效成分[J].中成药，2013,35(1):100-104.

[12] 刘晓娜，高彦华，乔喜芹，等.复方甘草片中甘草酸、异甘草苷、异甘草素的测定[J]. 黑龙江医药，2006,19(1):1-3.

[13] 杨红娟，郭伟斌，郑淑凤，等. RP-HPLC同时测定复方甘草片中4个成分的含量[J]. 药物分析杂志，2013, 33(1):141-145.

[14] 周 萃，杨燕云，张振秋，等. 波长切换HPLC法同时测定甘草及其炮制品中7个物质的含量[J]. 药物分析杂志，2011, 31(11):2067-2072.

[15] 曾英彤，黄志军，李泽华.HPLC法测定复方甘草片中甘草酸的含量[J].中国药师，2009,12(11):1584-1585.

[16] 赵晓莉，陈晓燕，狄留庆，等.HPLC法测定络通胶囊中绿原酸、阿魏酸、甘草苷、甘草素、肉桂酸和哈巴俄苷[J].中草药，2008，39(2):212-215.

[17] 段天璇，于密密，刘春生，等. HPLC法同时测定甘草指纹图谱暨甘草苷、甘草酸含量[J]．中成药， 2006，28(2):161-164.