醋莪术配方颗粒HPLC指纹图谱研究

聂英军，傅超美，廖 婉，傅 舒，严 鑫，甘彦雄

(成都中医药大学药学院，四川 成都 611137)

醋莪术配方颗粒HPLC指纹图谱研究

聂英军，傅超美，廖 婉，傅 舒，严 鑫，甘彦雄

(成都中医药大学药学院，四川 成都 611137)

采用HPLC法，色谱柱为Dikma Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，以乙腈—水为流动相，梯度洗脱，检测波长254 nm，色谱柱柱温30℃，流速1.0 mL/min.建立了醋莪术饮片HPLC指纹图谱共有模式，标定了8个主要共有峰，并利用计算机辅助相似性评价系统对指纹图谱进行相似度分析，表明相似度较大.实验结果表明:该指纹图谱研究方法简便可靠，重复性好，可作为目前醋莪术配方颗粒内在质量控制有效方法之一.

醋莪术配方颗粒;HPLC;指纹图谱;质量控制

0 引言

莪术始载于《药性论》，是破血消 要药，莪术炮制始载于南北朝的《雷公炮炙论》，醋制后入肝经血分，其活血化瘀、消积止痛作用增强，同时也可缓和其峻猛的药性.《中国药典》2010年版同时收载生莪术与醋莪术2种规格［1］.醋莪术配方颗粒是中药新型饮片，目前已投入临床应用［2－3］.相对于传统以单个或少数主要成分作为指标来控制醋莪术质量的方法［4－6］，HPLC 指纹图谱能比较全面地反映中药中所含化学成分的种类与数量，更好地表明中药的内在质量［7－9］，所以本研究拟采取 HPLC 指纹图谱法，以建立醋莪术配方颗粒质量标准.

1 仪器与材料

1.1 仪 器

实验所用的仪器包括:岛津LC－10AT高效液相色谱仪(SPD－10AT紫外检测器、LC－10AT色谱泵)，江申JS－3030色谱工作站.

1.2 试 药

实验所用试药包括:莪术醇对照品(批号，120924;纯度，HPLC≥98%);莪术二酮对照品(批号，120726;纯度，HPLC≥98%)，2种对照品均购自于四川省维克奇生物科技有限公司;水为重蒸水(自制)，甲醇为色谱纯，其余试剂纯度均为分析纯.

1.3 药 材

实验所用的药材包括:醋莪术饮片10批，其生产厂家及批号如表1所示，配方颗粒按照最佳制备工艺制备而成.药材经成都中医药大学中药标本中心卢先明教授鉴定为醋制姜科植物蓬莪术的干燥根茎.

表1 醋莪术药材饮片编号表

2 方法与结果

2.1 色谱条件

实验的色谱条件为:色谱柱，Dikma Diamonsil C18柱(Dikma 公司，5 μm，4.6 mm × 250 mm)，检测波长，254 nm，流动相，乙腈(A)—水(B);梯度洗脱程序为:0 min→5 min，乙腈10%，水90%;5 min→30 min，乙腈20%，水80%;30 min→35 min，乙腈21%，水79%;35 min→45 min，乙腈35%，水 65%;45 min→90 min，乙腈 37%，水 63%;90 min→120 min，乙腈45%，水55%;120 min→160 min，乙腈50%→80%，水50%→20%;DAD检测器，流速1.0 mL/min;色谱柱柱温30℃.

2.2 供试品溶液的制备

精密称定醋莪术配方颗粒1 g，置于三角锥形瓶中，加入100%甲醇40 mL，称重，超声提取(频率20 kHz，功率250 W)1 h 后，称重后补重，0.45 μm 微孔滤膜滤过，制得供试品溶液.

2.3 对照品溶液的制备

精密称定莪术醇、莪术二酮对照品适量于容量瓶中，加入适量甲醇，振摇，定容，制得含0.00810 mg/mL莪术醇，0.00425 mg/mL莪术二酮的混合对照品溶液.

2.4 测定方法

精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10 μL，进样，采集160 min内的色谱峰.

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察.

取醋莪术配方颗粒供试品溶液，连续进样6次后，分别对保留时间为 18、51、70、75、121、128、141、144 min的8个主要共有色谱峰进行考察.结果显示，各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，各共有峰的相对保留时间RSD为，0.11%～0.67%，各共有峰的相对峰面积RSD为，0.6% ～1.65%，表明本方法精密度良好.

2.5.2 稳定性考察.

取醋莪术配方颗粒供试品溶液，选取时间点0、1、2、4、8、12、24、48 h 进样检测，计算指纹图谱中保留时间为 18、51、70、75、121、128、141、144 min 的 8个主要共有色谱峰峰面积.由计算结果可知，各共有峰的相对保留时间RSD为，0.45% ～1.05%，各共有峰的相对峰面积RSD为，0.73% ～1.64%，表明该样品在48 h内稳定性良好.

2.5.3 重复性考察.

取同一批次制得的醋莪术配方颗粒6组，对指纹图谱中保留时间为 18、51、70、75、121、128、141、144 min的8个主要共有色谱峰进行考察，采集峰面积数值，计算15个主要色谱峰的相对保留时间与峰面积.由计算结果可知，各共有峰的相对保留时间RSD为，0.20%～0.75%，各共有峰的相对峰面积RSD为，0.46% ～1.04%，表明本测定方法重复性良好.

2.6 HPLC指纹图谱共有色谱峰确认

对10批次醋莪术配方颗粒指纹图谱中的色谱峰进行校正，将分离度较差的色谱峰去除，最终确定8个色谱峰为特征峰.吸取10 μL对照品溶液，进样，通过分析色谱峰保留时间与峰面积确定其色谱峰相似性归属.

2.7 样品测定结果

2.7.1 指纹图谱的检测.

精密称定10组不同批次醋莪术配方颗粒，每组1 g，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下方法制备对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行检测，采集160 min中色谱峰保留时间与峰面积数值.使用“中药色谱图分析与数据管理系统”应用软件，对数据进行统计分析，结果如图1所示.

图1 混合对照品溶液的HPLC指纹图谱识别

2.7.2 指纹图谱的相似度计算.

使用“中药色谱图分析与数据管理系统”应用软件.以S1样品谱图为相似度计算的校正参照谱图，时间窗宽度大小为0.1 min，采用平均算法，以多项式最小二乘拟合平滑法控制噪音，将参照谱图作为基准，各样品的指纹图谱和对照图谱进行对比，通过计算得各不同批次醋莪术配方颗粒的相似度，结果如表2、图2～3所示.

表2 指纹图谱相似度测定

图2 醋莪术配方颗粒HPLC手动匹配MARK峰与指纹图谱共有模式

图3 10批次不同醋莪术配方颗粒HPLC指纹图谱叠加谱图

由实验结果可知，对不同厂家与批次的同一基源制备的醋莪术配方颗粒，使用本研究方法所得10个不同批次醋莪术配方颗粒的指纹图谱的相似度和校正参照图谱相似度均在0.9以上.此与其药材的产地均为四川有关，但使用夹角余弦法与相关系数法所计算得的相似度有略微差别.

3 讨论

3.1 醋莪术配方颗粒指纹图谱色谱条件的选择

使用DAD检测器对样品在波长200～800 nm下进行全波长扫描，并结合相关文献数据发现，醋莪术HPLC指纹图谱于波长320～200 nm下色谱峰较多，故本研究选用310、280、254、216 nm 作为考察波长.结果显示，在280 nm与254 nm 2个波长下色谱峰的吸收度最大，且峰形完好.由于波长280 nm下色谱峰的分离度较波长254 nm下色谱峰分离度低，且在154 min后的基线有向上漂移的现象发生，故最终考虑确定波长254 nm为指纹图谱的测定波长.

醋莪术配方颗粒HPLC指纹图谱中测定的成分主要是挥发油中小分子成分，有些化合物的结构较为相似，甚至通过氧化、还原、催化等途径发生某些化合物之间的结构重排或者相互转化，如莪术烯与呋喃二烯，导致部分色谱峰的分离难度增大，特别是在36～53 min之内的色谱峰群.

3.2 配方颗粒研究的必要性

大多数批次的醋莪术配方颗粒HPLC指纹图谱在152 min内均能出峰完全，而少量批次中在保留时间为154 min左右任然会出现一个很小的色谱峰，如使用四川新荷花中药饮片厂的醋莪术饮片制备的配方颗粒，所以在指纹图谱测定中，设定保留时间为160 min，而且以色谱峰数量最多的四川新荷花中药饮片厂的醋莪术饮片制备的配方颗粒测定得到的指纹图谱作为参照谱图.

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］涂瑶生.“一方”单味中药浓缩颗粒的现代化、产业化进程与思考［J］.中医药现代化，2001，3(3):24 －28.

［3］涂瑶生，毕晓黎.中药配方颗粒国际化有关问题的思考［J］.中医药现代化，2007，9(2):77 －81.

［4］郝普彦，郭力，许莉，等.不同种黄草石斛的HPLC指纹图谱研究［J］.中药与临床，2013，4(2):1 －3.

［5］廖婉，傅超美，章津铭，等.醋莪术饮片质量控制方法的研究［J］.华西药学杂志，2012，27(4):447 －449.

［6］廖婉，傅超美，章津铭，等.醋莪术饮片HPLC指纹图谱研究［J］.中药材，2012，35(10):1582 －1585.

［7］蔡宝昌，刘训红.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术［M］.北京:化学工业出版社，2005.

［8］王薇，康云鹰.论中药指纹图谱利弊及其应用前景［J］.现代中医药，2009，3(2):70 －71.

［9］覃葆，曾春晖，荣玲芝，等.不同炮制方法对广西莪术的质量研究［J］.时珍国医国药，2009，20(9):2247 －2248.

Study on HPLC Fingerprint of Vinegar Rhizoma Zedoariae Formula Particles

NIE Yingjun，FU Chaomei，LIAO Wan，FU Shu，YAN Xin，GAN Yanxiong
(College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China)

This paper adopts HPLC method，Dikma Diamonsil C18column(4.6 mm ×250 mm，5 μm)as chromatographic column，acetonitrile-water as mobile phase.Gradient elution is used.The detection wavelength is 254 nm.The column temperature is 30 ℃.The flow rate is 1.0 mL·min－1.The HPLC fingerprint common model of vinegar rhizoma zedoariae yinpian is established，and the eight main common peaks are calibrated.By the computer aided similarity evaluation system，fingerprint similarity is analyzed，which indicates greater similarity.The experimental results show that this method is simple and reliable，and has good repeatability，which can be regarded as one of the effective methods for intrinsic quality control of vinegar rhizoma zedoariae formula particles.

vinegar rhizoma zedoariae formula particles;HPLC;fingerprint;quality control

R944.2+7

A

1004－5422(2014)01－0004－04

2014－01－16.

四川省科技支撑计划(2013S20123)、四川省中医药管理局科技专项(2012－E－041)与四川省科技创新苗子工程(20133006)资助项目.

聂英军(1986—)，男，硕士研究生，从事中药新制剂、新技术与新工艺研究.