绿原酸对草鱼鱼种生长、非特异性免疫和肉质的影响

李乃顺 冷向军 李小勤 刘 波 柴仙琦 李忠铭 郑小淼

(上海海洋大学, 农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)

绿原酸对草鱼鱼种生长、非特异性免疫和肉质的影响

李乃顺 冷向军 李小勤 刘 波 柴仙琦 李忠铭 郑小淼

(上海海洋大学, 农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)

为考察绿原酸对草鱼鱼种生长、非特异性免疫指标和肌肉品质的影响, 在基础饲料中分别添加0.00%(对照组)、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%绿原酸, 饲养平均体重(3.19±0.03) g的草鱼鱼种。经60d饲养, 各组草鱼增重率分别为 283.1%、305.7%、307.3%、329.6%、308.3%、303.0%, 饲料系数分别为1.45、1.33、1.33、1.26、1.30、1.36; 与对照组相比, 添加0.04%绿原酸显著提高草鱼鱼种增重率, 降低了饲料系数(P＜0.05), 添加 0.01%、0.02%、0.06%绿原酸有提高草鱼鱼种增重率的趋势; 在饲料中添加 0.04%绿原酸可显著提高肝胰脏 SOD活性(P＜0.05), 添加 0.08%绿原酸可显著降低血浆天门冬氨酸氨基转移酶活性(P＜0.05), 各组肝胰脏溶菌酶、血浆碱性磷酸酶和丙氨酸氨基转移酶活性无显著差异(P＞0.05)。对肌肉成分的分析表明, 各组水分、粗脂肪含量无显著差异(P＞0.05), 但添加 0.04%绿原酸可显著提高肌肉粗蛋白、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸、必需氨基酸和总氨基酸含量(P＜0.05)。添加0.02%绿原酸可显著提高肌肉羟脯氨酸、胶原蛋白含量(P＜0.05)。综上所述, 适量绿原酸能改善草鱼鱼种生长性能、非特异性免疫功能和肌肉品质。草鱼鱼种饲料中绿原酸添加量推荐为0.04%。

草鱼鱼种; 绿原酸; 生长; 非特异性免疫; 肉质

杜仲(Eucommia ulmoides Olive)属杜仲科、杜仲属, 为一种名贵中药材。杜仲作为天然植物, 具有多功能性、无药残、无耐药性等优点。传统中医认为, 杜仲具有补肝肾、强筋骨、降血压等功效, 用于肝肾不足, 头晕目眩, 腰膝酸痛, 筋骨瘘软等[1]。目前, 有关杜仲在动物养殖业中的应用已见于猪[2,3]、鸡[4—6]、草鱼[7,8]、鲤[9,10]等, 这些研究表明, 杜仲可改善动物的生长性能、肌肉品质和免疫功能, 这些作用效果与其活性成分绿原酸、桃叶珊瑚甙、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖甙等有关[3,7,11,12]。

绿原酸是一类多酚化合物, 具有抗氧化[13]、抗糖尿病[14]、抗高血糖[15]、抗应激[16]、抗病毒[17,18]等作用。目前, 绿原酸已被应用于食品、医药等行业[18—20], 而在动物养殖方面的研究很少。在中华鳖[21]和建鲤[22]的研究表明绿原酸能提高动物生长性能、改善肉质, 增强非特异性免疫和抗氧化能力。绿原酸在其他水产动物方面的研究尚未见报道。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国最为重要的养殖鱼类之一。本次研究以草鱼鱼种为实验对象, 在饲料中添加不同剂量绿原酸, 考察对草鱼鱼种生长、非特异性免疫相关指标和肌肉品质的影响,为中草药提取物在水产养殖业中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计与实验饲料

在基础饲料中分别添加0.00%(对照组)、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%绿原酸, 共6个处理组, 每组设3个平行。饲料配制时, 所添加的绿原酸以等量减少麦麸用量保持配方平衡。饲料以颗粒机(浙江新昌城关陈氏机械厂KL系列105A-4-2型)制成粒径2 mm沉性颗粒。基础饲料组成及成分分析见表1。绿原酸购于成都康邦生物科技有限公司, 含量≥98%。

表1 基础饲料配方组成及营养成分含量Tab.1 Ingredient and nutritional composition of basal diet

1.2 实验用鱼

实验用草鱼鱼种平均体重(3.19±0.03) g, 体质健壮, 规格整齐, 购于上海市根敏水产专业合作社。

1.3 饲养管理

养殖实验在上海海洋大学南汇水产养殖场进行。在正式实验前, 草鱼鱼种放入暂养池驯化一周以适应实验饲料及环境, 选取 810尾草鱼鱼种移入18个网箱(2 m×1.2 m×1 m), 网箱置于水泥池(5.0 m ×3.0 m×1.2 m) 中, 每网箱 45尾。每天按体重3%—5%分3次(8:00、12:00、16:00)投喂, 根据水温、摄食情况进行调整, 各网箱保持基本一致的投饲量。饲养时间为2012年8月23日—10月21日, 为期 60d。饲养期间水温(22—30)℃, DO＞5 mg/L、NH3-N＜0.3 mg/L。

1.4 测定指标与方法

生长性能和形体指标 于养殖实验开始及结束时称量各组实验鱼的体重, 称量前鱼体饥饿24h。计算相对增重率、饲料系数和成活率等; 随机取鱼6尾, 测其体重、体长、内脏重、肝脏重, 计算肝体比、脏体比、肥满度等形体指标。

相对增重率(%)=(末重–初重)(g)/初重(g)×100

饲料系数(FCR)=摄食量(g)/鱼体增重量(g)

成活率(%)=实验末鱼尾数/实验初鱼尾数×100

肝体比=肝脏重量(g)/体重(g)

脏体比=内脏重量(g)/体重(g)

肥满度(K)=鱼体重(g)/鱼体长3(cm3)

血浆和肝胰脏生化指标 在饲养实验结束后,每网箱取鱼6尾, 以尾静脉处采血(1%肝素钠抗凝), 6000 r/min离心 10min, 取上清液于–20℃冻存, 测定碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。ALP、AST、ALT活性测定分别采用AMP缓冲液法、紫外-苹果酸脱氢酶法、紫外-乳酸脱氢酶法(测试盒均购自迈瑞公司), 于迈瑞BS-200全自动生化分析仪上完成。

在饲养实验结束后, 每网箱取鱼 6尾, 分别取其肝脏并剪碎, 加入预冷的生理盐水进行匀浆(3—4min), 4℃下离心10min(6000 r/min), 取上清液在–20℃下冻存, 测定溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)活力。LSZ测定采用比浊法; SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法(测试盒均购自南京建成生物技术研究所)。比活力单位用每mg蛋白样品所含的酶量, 即U/mg蛋白质表示。

肌肉成分分析 在饲养实验结束后, 每池随机取鱼 15尾, 取背部肌肉–20℃冻存备测。水分测定采用 105℃烘干法, 粗蛋白测定采用凯氏定氮法,粗脂肪测定采用氯仿甲醇法, 胶原蛋白由羟脯氨酸乘以换算系数11.1而来[23], 羟脯氨酸测定采用碱水解法(测试盒均购自南京建成生物技术研究所), 其原理为羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色, 根据呈色深浅可测算其含量。

在测定肌肉常规成分后, 将每网箱15尾肌肉合并为一个样本(每处理3个样本), 以6 mol/L盐酸水解, 用Sykam433D氨基酸自动分析仪测定肌肉氨基酸组成。

1.5 数据分析与处理

实验所得数据以平均数±标准差表示, 用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析, 差异显著者进行LSD多重比较, P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 对草鱼鱼种生长性能和形体指标的影响

经过 60d饲养, 饲料中添加绿原酸对草鱼鱼种生长性能的影响见表 2。在饲料中添加 0.01%—0.08%绿原酸后, 均在不同程度上提高了鱼体增重率, 降低了饲料系数。其中添加0.04%绿原酸组草鱼鱼种增重率较对照组提高16.4%(P＜0.05), 饲料系数降低13.1%(P＜0.05)。与对照组相比, 添加0.01%、0.02%、0.06%绿原酸也显著降低了饲料系数(P＜0.05), 并有提高增重率的趋势(P＞0.05)。由表 3可见, 各处理组在肥满度、肝体比、脏体比之间无显著差异(P＞0.05)。

2.2 对草鱼鱼种血浆生化指标的影响

在饲料中添加绿原酸对草鱼鱼种血浆 AST、ALT、ALP活性的影响见表 4。在 AST活性方面, 0.08%绿原酸组 AST活性显著低于对照组(P＜0.05),其余各组和对照组之间无显著差异(P＞0.05); 各处理组在 ALT活性方面无显著差异(P＞0.05); 添加0.01%—0.08%绿原酸, 在数值上增加了 ALP活性,其中0.04%组最高, 但无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 对草鱼鱼种肝胰脏SOD、溶菌酶活力的影响

表2 绿原酸对草鱼鱼种生长性能的影响(平均值±标准差)Tab. 2 Effects of chlorogenic acid on growth performances of juvenile grass carp (means±SD)

表3 绿原酸对草鱼鱼种形体指标和内脏指数的影响(平均值±标准差)Tab. 3 Effects of chlorogenic acid on physical indicator and visceral index of juvenile grass carp (means±SD)

对于肝胰脏非特异性免疫指标的测定表明(表5), 饲料中添加0.04%绿原酸可显著提高SOD活性(P＜0.05), 各处理组溶菌酶活性无显著差异(P＞0.05)。

表4 绿原酸对草鱼鱼种血浆生化指标的影响(平均值±标准差)Tab. 4 Effects of chlorogenic acid on plasma biochemical indicator of juvenile grass carp (means±SD)

表5 绿原酸对草鱼鱼种肝胰脏SOD、溶菌酶活力影响(平均值±标准差)Tab. 5 Effects of chlorogenic acid on hepato-pancreas SOD, LSZ activities of juvenile grass carp (means±SD)

2.4 对草鱼鱼种肌肉成分的影响

由表 6可见, 随着配方中绿原酸的增加, 草鱼鱼种肌肉粗蛋白、胶原蛋白含量呈先升高后降低趋势。其中 0.04%绿原酸组的肌肉粗蛋白显著高于对照组(P＜0.05), 0.02%绿原酸组的肌肉胶原蛋白显著高于对照组(P＜0.05); 各处理组在肌肉水分、粗脂肪含量间无显著差异(P＞0.05)。

2.5 对草鱼鱼种肌肉氨基酸组成的影响

对肌肉氨基酸的测定表明(表7), 添加0.01%绿原酸可显著增加肌肉缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸含量(P＜0.05); 添加0.02%绿原酸可显著增加肌肉缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸含量(P＜0.05), 较对照组提高鲜味氨基酸含量19.6%(P＜0.05); 添加0.04%、0.06%和0.08%绿原酸组可显著增加缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸含量; 添加0.02%、0.04%和0.06%绿原酸组均可显著增加肌肉氨基酸总量和必需氨基酸含量(P＜0.05)。

3 讨论

表6 绿原酸对草鱼鱼种肌肉组成的影响(鲜重) (平均值±标准差)Tab. 6 Effects of chlorogenic acid on muscle composition of juvenile grass carp (fresh tissue) (means±SD)

3.1 绿原酸对草鱼鱼种生长的影响

目前, 杜仲应用于动物养殖业的报道已见于猪[2,3]、鸡[4—6]、草鱼[7,8]、鲤[9,10]等, 但关于其主要活性成分绿原酸在动物养殖业中的研究则很少。在饲料中添加200 mg/kg绿原酸, 可显著提高中华鳖增重率[21], 也提高了建鲤增重率38.2%[22]。在本实验中,草鱼鱼种摄食含 0.04%绿原酸饲料后, 其增重率较对照组提高 16.4%, 饲料系数降低 13.1%(P＜0.05),但高剂量的绿原酸(0.08%)添加并没有进一步促进草鱼鱼种的生长, 这在中华鳖[21]、建鲤[22]的研究中也有类似报道。这些结果表明, 适宜添加量的绿原酸对水产动物的生长性能有改善作用, 其作用机理可能与绿原酸具有广谱抗菌性[11,21,25,26], 具有抗氧化、清除自由基作用[27,28]有关, 从而改善了机体健康功能, 提高动物生长性能。此外, 在养殖过程中发现, 摄食含绿原酸饲料的草鱼鱼种, 食欲旺盛, 抢食积极主动。

表7 绿原酸对草鱼鱼种肌肉氨基酸组成的影响(脱脂DM g/100g) (平均值±标准差)Tab. 7 Effects of chlorogenic acid on muscle amino acids of juvenile grass carp (DM g/100g) (means±SD)

3.2 绿原酸对草鱼鱼种免疫功能的影响

研究表明, 绿原酸具有抗氧化[29,30]、抗菌[31]、增强动物机体免疫[32]等功效。在鱼类中, SOD、溶菌酶等是反映机体非特异性免疫功能较为重要的指标[33]。建鲤的实验表明, 在饲料中添加(200—400) mg/kg绿原酸能显著提高血浆溶菌酶、SOD活性, 增强抗氧化能力[22]; 在饲料中添加200和400 mg/kg绿原酸均能显著增强中华鳖血浆 SOD 活性(P＜0.05)[21];异育银鲫的研究表明, 在饲料中添加 400 mg/kg绿原酸并长时间(30d)饲喂时, 会抑制血清碱性磷酸酶(ALP)活性[34]; 在草鱼的实验中, 0.04%、0.08%绿原酸对血清溶菌酶活性无显著影响(P＞0.05)[35]。本实验在饲料中添加 0.04%绿原酸显著提高了草鱼鱼种肝胰脏SOD活性, 但添加0.08%绿原酸, 则显著降低了血浆 AST活性(P＜0.05), 各绿原酸添加组对肝胰脏溶菌酶活性无显著影响。这表明, 适宜添加量的绿原酸会对某些机体免疫指标和抗氧化指标产生影响, 但过高量的添加, 会带来负面作用, 这可能和高浓度绿原酸对鱼体产生一定的毒副作用有关,相关机理尚需进一步研究。

绿原酸的抗氧化功能与其多酚结构有关。在小鼠抗氧化实验中, 绿原酸是羟基自由基清除剂, 也是过氧自由基清除剂, 其可能的抗氧化机制和儿茶酚类似, 即作为过氧自由基接受氢原子供体, 终止链自由基反应[36]。

3.3 绿原酸对草鱼鱼种肌肉成分和品质的影响

杜仲及其提取物已被证明具有提高鸡[5]、草鱼[7]、鲤[9]、鳗[37]、异育银鲫[12,38]等肌肉蛋白和(或)机体胶原蛋白含量的作用, 而胶原蛋白是反映肌肉品质的重要指标; 此外, 在饲料中添加杜仲叶粉还显著提高了草鱼[7]、鲤[9]肌肉呈味氨基酸、总氨基酸及必需氨基酸含量(P＜0.05)。杜仲改善肉质的作用可能与其活性成分京尼平甙、桃叶珊瑚甙、绿原酸等有关。已有研究表明了京尼平甙和桃叶珊瑚甙二者可促进大鼠的胶原合成和表皮细胞增殖[39], 但在这方面关于绿原酸的研究很少。中华鳖的研究表明, 在饲料中添加200、400 mg/kg绿原酸, 可显著提高裙边和肌肉胶原蛋白含量, 其中 400 mg/kg绿原酸组的肌肉粗蛋白含量也较对照组显著提高(P＜0.05)[21]。本实验在饲料中添加 0.02%和 0.04%绿原酸, 显著增加了草鱼鱼种肌肉氨基酸总量和必需氨基酸含量,分别提高了肌肉胶原蛋白含量和粗蛋白含量(P＜0.05)。但绿原酸提高肌肉蛋白含量和胶原蛋白含量的机理是什么, 在杜仲的活性成分京尼平甙、桃叶珊瑚甙、绿原酸中, 各自对肌肉品质改善的贡献有多少, 均有待于进一步研究。

在本实验条件下, 在饲料中添加 0.04%绿原酸可显著提高草鱼鱼种增重率, 降低饲料系数, 提高肌肉粗蛋白含量、氨基酸含量和肝脏SOD活性; 草鱼鱼种饲料中绿原酸的添加量推荐为0.04%。

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THE EFFECTS OF CHLOROGENIC ACID ON THE GROWTH, NON-SPECIFIC IMMUNE INDEX AND THE MEAT QUALITY OF JUVENILE GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS)

LI Nai-Shun, LENG Xiang-Jun, LI Xiao-Qin, LIU Bo, CHAI Xian-Qi, LI Zhong-Ming and ZHENG Xiao-Miao
(Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To investigate the effects of chlorogenic acid on the growth, non-specific immune function and the meat quality of juvenile grass carp, the diets were improved with the addition of chlorogenic acid at the concentrations of 0.00% (control group), 0.01%, 0.02%, 0.04%, 0.06%, and 0.08%. Fish with an average weight of (3.19±0.03) g were selected and fed for 60 days. The results showed that the growth rate of the six diet groups were 283.1%, 305.7%, 307.3%, 329.6%, 308.3%, 303.0%, and the FCR was 1.45, 1.33, 1.33, 1.26, 1.30, and 1.36, respectively. The growth rate and FCR were significantly improved with the addition of 0.04% chlorogenic acid compared with the control group (P＜0.05). It was indicated that the growth yate was improved with the addition of chlorogenic acid at the concentrations of 0.01%, 0.02%, and 0.06%. SOD activities of hepato-pancreas increased significantly with 0.04% chlorogenic acid (P＜0.05), and plasma AST activities decreased significantly with 0.08% chlorogenic acid (P＜0.05). However, hepato-pancreas lysozyme, ALP and ALT of plasma activities were not affected by dietary chlorogenic acid (P＞0.05). In terms of the muscle composition and the meat quality, there were no significant differences in muscle moisture and crude lipid contents among different diet groups. The muscle protein, Val, Ile, His, essential amino acids and total amino acids significantly increased (P＜0.05) with the addition of 0.04% chlorogenic acid. Hydroxyproline and the collagen content of muscle increased (P＜0.05) with the addition of 0.02% chlorogenic acid. In conclusion, the results above showed that the growth, non-specific immunity ability and the meat quality of juvenile grass carp could be improved with the addition of chlorogenic acid in diets. Therefore, the recommended level of chlorogenic acid in juvenile grass carp diet should be 0.04%.

Juvenile grass carp; Chlorogenic acid; Growth; Non-special immunity; Meat quality

S963

A

1000-3207(2014)04-0619-08

10.7541/2014.88

2013-03-20;

2013-12-19

上海市农委“科技兴农”重点攻关项目(2009-6-6); 上海市重点学科建设项目(Y1101) 资助

李乃顺(1987—), 男, 浙江杭州人; 硕士; 主要研究方向为水产动物营养与饲料学。E-mail: linaishun@163.com

冷向军(1972—), 男, 四川眉山人; 博士生导师; 主要研究方向为动物营养与饲料学、饲料加工工艺学、饲料与水产品安全等。E-mail: xjleng@shou.edu.cn