EGFR单抗的耐药机制及食管癌治疗进展

卫 彬,张晓慧(综述)，陈小飞，高 勇(审校)

(南京医科大学附属淮安第一医院肿瘤科,江苏 淮安 223300)

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)过表达于多种上皮性肿瘤中，使EGFR单抗成为恶性肿瘤治疗的重要手段。EGFR单抗虽已应用于多种实体肿瘤，如结肠癌、胃癌及头颈部鳞癌等，但其耐药性严重制约着靶向药物的疗效。近年来，已有一些关于EGFR单抗在食管癌中应用的临床研究。该文通过综述EGFR单抗在恶性肿瘤中的耐药机制、相关的分子标志物、逆转耐药的方法及其在食管癌中应用的临床研究，以期通过研究EGFR单抗在食管癌治疗中的耐药特点，寻找在EGFR单抗治疗中获益的优势人群，开展EGFR单抗在食管癌中的个体化治疗。

1 EGFR与肿瘤

EGFR为配体依耐性酪氨酸激酶受体[1]，属人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,HER)家族，由胞外结构域、跨膜结构域、膜旁连接域、胞内酪氨酸激酶域和C端调控域组成。EGFR通过形成稳定同源(或异源)二聚体发生自我磷酸化，最终激活细胞内多种信号通路的瀑布效应。EGFR多表达于上皮、间叶和神经组织。生理情况下，EGFR的活化受表皮生长因子调控，活化的EGFR可通过内化或下调来阻断信号持续转导；而肿瘤中因EGFR基因突变、扩增、降解异常及其配体的上调等因素可引起EGFR异常活化。已知与EGFR相关的肿瘤包括头颈部鳞癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等[2]。

EGFR信号通路可调节细胞的分裂、运动、侵袭、黏附、细胞修复和存活(或死亡)等。目前与肿瘤发生、发展及转归相关的EGFR通路主要有促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，可激活参与肿瘤细胞的增殖、肿瘤的侵袭和转移的相关激酶及转录因子；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路，通过活化蛋白激酶B(protein kinase B，又称AKT)调节多种底物，最终影响细胞生存、增殖和细胞的新陈代谢；磷脂酶C/蛋白激酶C通路，磷脂酶C被二酰甘油活化后,可激活影响细胞的增殖、凋亡、细胞存活和细胞转移的相关因子；JAK-STAT通路，该通路已被证实可激活转录，诱导细胞转化、调控某些与细胞增殖；核EGFR信号通路，核EGFR可调节基因的启动子和稳定增殖细胞核抗原以加强肿瘤细胞的增殖潜能，最终导致肿瘤的生长和进展[2-4]。

2 EGFR单抗的耐药机制

目前临床上最常用的单抗为人鼠嵌合型IgG1-Cetuximab，其他还包括人源型IgG1-Nimotuzumab、完全人源型IgG2-Panitumumab及人源型IgG1-Matuzumab等。EGFR单抗可通过多种作用机制发挥抗肿瘤作用(图1)[2,5-6]，如直接与EGFR结合阻断其信号通路，阻断HER家族介导的信号通路；单抗诱导EGFR内化及降解，抑制其下游的信号转导；通过阻止肿瘤细胞由G1期向S期转变来抑制肿瘤的增殖；通过下调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)来抑制肿瘤的血管形成；通过上调促凋亡因子Bax及下调凋亡抑制因子Bcl-2来诱导肿瘤的凋亡；通过抗体依赖性细胞毒性作用引起肿瘤细胞的死亡。EGFR单抗虽可提高患者的整体反应率，但并没有有效延迟患者的无进展生存期，而制约患者疗效的可能因素是单抗存在的耐药问题。

TGFα：转化生长因子α

2.1血管生成 肿瘤的血管生成受多种血管生成因子的调节，EGFR单抗耐药的肿瘤中存在促血管生成因子的上调来刺激肿瘤血管的生成，如VEGF，而EGFR的表达水平却未见升高。当通过基因转染诱导细胞高表达VEGF可诱导敏感细胞肿瘤耐药，而使用血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptors，VEGFR)-EGFR双重抑制剂ZD6474(凡德他尼)可逆转耐药[7]。又有研究发现，VEGFR-1过表达也可诱导肿瘤对单抗耐药，ZD6474或沉默VEGFR-1基因也可恢复耐药细胞对单抗的敏感性[8]。

2.2EGFR下游效应分子的异常 EGFR单抗不能抑制存在KRAS基因突变的EGFR信号通路，该通路的持续活化使肿瘤表现出对单抗的耐药，而野生型患者对单抗治疗较敏感[9]；除突变型KRAS外，野生型KRAS基因扩增也可诱导患者对单抗耐药；且联合MEK(MAPK激酶)抑制剂或BRAF(MAPK激酶激酶)抑制剂时可恢复患者对单抗的敏感性[10]。研究表明,肿瘤中PTEN(人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因)蛋白的异常降解可导致其对EGFR单抗耐药，而使用蛋白酶体抑制剂(MG-132)通过阻止PTEN降解来抑制AKT活化，阻断PI3K/AKT通路达到逆转耐药的目的。但通过转染诱导耐药细胞高表达PTEN蛋白时，因PTEN被快速降解未能逆转耐药[11]。其次Src家族激酶(Src family kinase,SFK)高活性可诱导EGFR降解异常和PI3K/AKT通路及HER-3活化异常，均导致肿瘤对单抗耐药，SFK抑制剂可逆转耐药[12]。

2.3EGFR的亚细胞定位 EGFR可定位于细胞内的内涵体、线粒体及细胞核等，核EGFR信号通路可参与多种肿瘤的生长和转移。Li等[13]发现，Cetuximab耐药系的核EGFR水平明显升高，其可诱导增殖相关基因的表达；同时耐药系也存在SFK高表达。EGFR的核定位受SFK的影响，SFK抑制剂可通过下调核EGFR和上调膜EGFR水平来逆转耐药，可见SFK高表达的肿瘤细胞可逃脱EGFR单抗的杀伤作用。Nevo等[14]指出，乳腺源性生长因子抑制剂也可通过使EGFR细胞内定位诱导肿瘤对单抗耐药。

2.4HER家族生长因子表达上调 EGFR单抗耐药的细胞系可存在HER家族配体的过表达，如转化生长因子α、转化生长因子β、表皮生长因子、肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF)、双调蛋白等[15]。Hatakeyama等[16]研究发现，EGFR单抗耐药的头颈部鳞状细胞癌细胞系存在HB-EGF上调和miR-212下调，而使用HB-EGF抑制剂或诱导miR-212上调可恢复肿瘤对单抗的敏感性；证实HB-EGF的上调可诱导肿瘤对EGFR单抗耐药。同时检测该肿瘤标本发现HB-EGF、转化生长因子α及双向调节蛋白均有表达，但HB-EGF在肿瘤复发患者标本中表达水平更高。

2.5HER家族成员活化 研究发现，EGFR单抗耐药的非小细胞肺癌和头颈部鳞癌细胞系中EGFR、HER-2、HER-3和肝细胞生长因子受体表达水平上调，同时发现EGFR与其他3种受体的结合能力增强，表明EGFR的异源二聚化可能是诱导肿瘤对EGFR-单抗耐药的机制之一[2]。Wheeler等[17]证实了非小细胞肺癌细胞系中，高表达的膜EGFR可与HER-2或HER-3异二聚化诱导肿瘤耐药；阻止异二聚化可通过阻断下游信号通路(如PI3K/AKT通路)来恢复肿瘤对单抗的敏感性。同时其他EGFR家族成员在肿瘤耐药中的作用也逐渐被发现，如HER-2基因的扩增，Martin等[18]发现4%(7/170)的野生型KRAS患者存在HER-2扩增，且对单抗疗效差，61%(104/170)的患者部分肿瘤细胞存在HER-2扩增，该组患者生存率最高，35%(59/170)的患者无HER-2扩增，其临床反应介于两者之间，证实了HER-2基因扩增可诱导单抗耐药。其他研究发现，HER-2/HER-3的异常激活也可诱导肿瘤对单抗耐药[19]。

2.6上皮细胞-间质转化 EGFR单抗对上皮型肿瘤有较好的疗效，而对间质型肿瘤的疗效较差，因此，上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)也可影响肿瘤对EGFR单抗的敏感性。EMT的主要特点是：连接蛋白的缺失(如钙黏素)，细胞支架蛋白的增加(如波形蛋白)及细胞侵袭能力的增强等。Basu等[20]通过上皮钙黏素和波形蛋白的水平将鳞状细胞癌分为上皮型和间质型，发现间质型鳞癌对Cetuximab耐药，且间质型细胞系EGFR水平下调，EMT相关基因的表达上调及增殖水平低。同时发现耐药系的波形蛋白表达水平增加了2倍多。对EGFR单抗耐药的肝癌细胞系中也证实了EMT的作用[21]。

2.7死亡相关蛋白激酶基因甲基化 死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)作为促凋亡蛋白，通过参与凋亡通路来促进细胞凋亡、细胞黏附和抑制细胞迁移等抑制肿瘤的发生。Ogawa等[22]用非小细胞肺癌与头颈部鳞状细胞癌亲本细胞系培养出对Cetuximab耐药的子代细胞系,发现耐药细胞系中DAPK基因均高度甲基化，而将DAPK转染至耐药细胞可恢复其对EGFR单抗的敏感性；同时剔除EGFR单抗敏感的亲本细胞系的DAPK基因可诱导其耐药。可见，DAPK启动子甲基化可使该基因沉默而诱导肿瘤对EGFR单抗耐药。

EGFR单抗已经成功应用于临床，但其存在的耐药问题仍严重制约其临床疗效，如何逆转肿瘤对单抗的耐药和提高疗效，在今后研究中显得尤为重要。对耐药机制的深入研究发现，目前减少或逆转EGFR单抗耐药的方法主要包括：①寻找EGFR单抗疗效相关的分子标志物，如EGFR基因及其配体水平，PTEN蛋白，EGFR、KRAS、BRAF及PIK3CA(编码PI3K亚基)基因突变，上皮钙黏素等[2,23-25]。②联合应用靶向药物阻断耐药通路，可根据肿瘤具体的耐药机制联合相应的靶向药物。转化生长因子β过表达时联合转化生长因子抑制剂；肿瘤血管生成可联合VEGFR-EGFR双重抑制剂；突变型KRAS患者联合BRAF抑制剂；突变型BRAF患者联合BRAF抑制剂(索拉非尼)；PTEN降解异常时可联合蛋白酶体抑制剂(MG-132)；SFK高活性时联合SFK抑制剂，pSTAT3过表达时联合STAT-3抑制剂[5,7,9,11,26]。

3 EGFR单抗在食管癌中的应用

临床研究发现，放化疗联合EGFR单抗治疗转移性结直肠癌、头颈部鳞癌等有显著的临床疗效[2]。食管癌作为常见的消化道肿瘤，临床上治疗转移性食管癌以联合放化疗方案最为有效，其临床疗效并不高。研究表明，50%～70%的食管癌患者存在EGFR高表达，并与预后不良有密切关系[27]，为EGFR单抗在食管癌中的应用提供了依据(表1)。

表1 EGFR-单抗在食管癌中的研究进展

3.1单抗单独应用 Gold等[28]Ⅱ期临床研究单独采用Cetuximab(静脉注射)作为二线药物治疗55例食管腺癌患者，其6个月的总生存率为36%，中位生存期为4.0个月，中位无进展生存期为1.8个月，而该方案并未提高6个月内患者的总生存率及生存期。因此，不推荐单用Cetuximab作为转移性食管腺癌二线治疗药物。

3.2单抗联合化疗 Lorenzen等[29]随机Ⅱ期临床研究(62例食管鳞癌患者)分别采用CF(30例)方案(顺铂加5-氟尿嘧啶)或Cetuximab-CF(32例)方案治疗食管鳞癌患者6个周期。除皮疹和腹泻在Cetuximab-CF和CF两组的发生率分别为6%(2)、0%(0)和16%(5)、0%(0)外，Cetuximab并没有加剧3/4级不良反应。同时两组的整体反应率和疾病控制率分别为19%(6/32)、13%(4/30)和75%(24/30)、57%(17/30)。中位无进展生存期和中位生存期分别为5.9、3.6个月和9.5、5.5个月。证实了Cetuximab联合CF方案具有良好的安全性，并可增加CF方案的疗效。

3.3单抗联合放化疗 Safran等[30]采用放化疗+Cetuximab方案治疗60例肿瘤患者(57例食管癌和3例胃癌，48例腺癌和12例鳞癌)，其中23%(14/60)的患者有Ⅲ级皮肤毒性或放射区外的面部出现瘙痒痤疮样皮疹；3例患者出现3/4级Cetuximab的变态反应，证实放化疗+Cetuximab方案具有较好的安全性，且治疗后70%(42/60)的患者有较好的临床反应。Chen等[31]采用放化疗联合Cetuximab方案治疗食管鳞癌发现，该方案的在中国人群中也表现出较理想的临床疗效和安全性。Ramos-Suzarte等[32]Ⅱ期临床对照研究证实了含Nimotuzumab的放化疗方案也可提高食管癌的临床疗效。

4 结 语

EGFR介导的信号通路可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移，抑制肿瘤细胞的凋亡和诱导肿瘤血的生成。EGFR单抗使肿瘤内科治疗有了新的选择，但由于肿瘤及对EGFR单抗耐药机制的复杂性，单抗对患者的疗效并不理想。对EGFR单抗的耐药机制研究，寻找疗效相关的分子标志物和逆转耐药的策略，在今后解决单抗耐药问题中尤为重要；目前联合多种分子靶向药物可在细胞水平上解决单抗的耐药，但需开展临床研究加以验证。临床研究表明，联合EGFR单抗的放化疗方案在食管癌中取得可观的临床疗效，但食管癌中单抗耐药机制并不明确，今后可就食管癌的耐药机制进行研究，同时可通过寻找EGFR单抗应用的优势人群，开展单抗在食管癌中的个体化治疗，以提高食管癌患者的临床疗效。

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