黄连副产物中生物碱含量测定及提取工艺研究

高 倩，罗旭梅，庞 婕，代 姝，王德珍，李学刚,2*

(1.西南大学 药学院，重庆 400716；2.重庆市黄连工程技术中心，重庆 400716)

黄连是毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch)的根茎，味苦、性寒，人心、肝、胃、大肠经，有清热燥湿，泻火解毒的功能[1]，《神农本草经》将其列为上品。黄连栽培成本比较高，如果能将黄连的须根和茎叶也充分利用，不仅更有效地利用了资源，也减少了生产成本[2]。近年研究证明，黄连须和黄连叶均含有不同程度的黄连生物碱，黄连须根含3%的生物碱[3]，现代药理研究表明，黄连主要有效成分生物碱类不仅具有抗菌、抗病毒的功效，还具有降血糖、降血脂、抗血小板凝集等药理作用[4]。已经有些单位开始将这些部位用于鱼和禽的饲料添加剂，防治易发传染病，证明确实有效，但目前的利用量还不足实际产量的1/10，仍旧需要加大研究和利用力度。

黄连生产副产物包括黄连叶、黄连叶柄、黄连须等。在黄连收获时，黄连地需要“亮棚”(去掉遮阴棚)，强光直接照射到植株上，黄连植株中所含的营养成分等将向根茎转移。黄连叶柄和须根中生物碱如何分布，作者目前尚无见到相关的研究报道。黄连采收时，部分叶柄和须根丢弃在田中，部分叶柄和须根随黄连一起进入下游加工并最后进入灰渣。搞清楚黄连生物碱在叶柄和须根中的分布，对于黄连副产物的开发利用，具有重要的参考价值。本实验利用HPLC分析监测技术，系统研究了黄连生物碱在5年生黄连叶、柄及须根中的分布，在单因素试验的基础上,采用正交试验探求黄连副产物中总生物碱的最佳提取工艺,为充分提高黄连资源的利用率[5]及新产品的开发研究提供依据。

1 仪器与试剂

1.1仪器日本岛津LC-20AD高效液相色谱仪。

1.2材料与试药黄连生产副产物来源于重庆石柱县；盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品鉴定所，11713-200911)。

2 方法与结果

2.1 黄连生物碱含量测定[6]

2.1.1 色谱条件 色谱柱Hypersil ODS2高效液相色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(50∶50)；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃；检测波长：345 nm。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取药材粉末(过2号筛)0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合液50 mL，密塞并称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min。放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，紧密量取续滤液2 ～10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱1 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，配成浓度为10 μg/mL的对照品储备液。

2.2 黄连加工副产物中黄连生物碱含量测定

2.2.1 样品含量的测定 精密称取药材粉末0.2 g，按“2.1.2”的方法制备供试品溶液，进样10 μL，按“2.1”的色谱条件依次进行测定，结果见表1。

表1 黄连加工废弃物生物碱含量

2.2.2 精密度试验 精密吸取取同一样品溶液，按“2.1”的色谱条件重复测定总生物碱含量6次，RSD为0.13 %，结果表明该方法精密度良好。

2.2.3 重复性试验 精密吸取同一样品溶液6份，按“2.1”的色谱条件重复测定总生物碱含量，RSD为0.72%，结果表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 精密吸取同一样品溶液3份，分别置于高温、高湿、光照的条件下24小时后测定总生物碱含量，RSD为0.21%，结果表明样品稳定性良好。

2.2.5 加样回收试验 精密吸取4份同一样品溶液0.5 ml，向其中加入1.0 ml盐酸小檗碱标准液，测定标准液的回收率，小檗碱平均回收率为94.925%；RSD为1.51%(n=4)。

2.3 单因素试验

2.3.1 酸度(V/V)[7-8]对黄连生物碱提取的影响 准确称取黄连须样品25 g,在料液比为1:15，硫酸浓度分别为0%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的条件下回流提取1 h，结果如图1所示，硫酸浓度为1.0%提取效果最好。

图1 酸度对黄连生物碱提取的影响

2.3.2 料液比对黄连生物碱提取的影响 准确称取黄连须样品25 g在硫酸浓度1.0%，料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的条件下试验，回流提取1 h，结果如图2所示。由图2可知，1∶15的料液比提取效果最佳。

图2 料液比对黄连生物碱提取的影响

2.3.3 提取时间对黄连生物碱提取的影响 准确称取黄连须25 g在硫酸浓度1.0%，料液比为1∶15，在提取时间分别为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h的条件进行回流提取试验。结果如图3所示。提取时间为1 h时生物碱含量达到最大提取率最高，而1 h后生物碱含量逐渐降低，所以综合考虑成本和生产周期，以回流提取1 h为佳。

图3 提取时间对黄连生物碱提取的影响

2.4 正交实验

2.4.1 正交试验设计 在单因素试验的基础上，对影响黄连生物碱提取的主要因素：硫酸浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)进行正交试验[9]，以测得的样品溶液中黄连总生物碱含量为考察指标，优选最佳提取工艺条件。因素水平见表2，正交试验结果见表3。

表2 黄连生物碱提取工艺的因素水平

表3 正交试验结果(n=9)

从表2的极差R值可以看出：影响黄连生产副产物中黄连生物碱提取的主次因素为:A>B>C,即硫酸浓度>料液比>提取时间。方差分析结果详见表4。

表4 方差分析结果

由表4可知，硫酸浓度对黄连生物碱提取率有显著影响，料液比、提取时间对黄连生物碱提取率无显著影响，综合上述各种因素，确定黄连生产副产物中黄连生物碱的最佳提取工艺条件为A3B2C2，即硫酸浓度为1.5%；料液比为1∶15；提取时间为1 h。

2.4.2 最佳提取工艺条件的验证 取重庆石柱县产地的黄连须4份，按照单因素试验结果进行总生物碱提取，平均提取率为3.089%(RSD=0.624%，n=4)。

3 讨 论

分析研究结果表明：黄连叶生物碱含量很低，桩口(靠近黄连的叶柄)生物碱含量很高(表1)，表明桩口的药用价值较高，而叶柄的利用价值较小，叶的利用价值也很小。黄连采收时，叶子和叶柄被剪下丢弃在田中，可见，丢弃在田中的叶子和叶柄没有多少利用价值。

黄连植株在生长过程中经过光照，生物碱逐渐向根茎运输，黄连须里生物碱也会由远离根茎的一端向根茎运输，沿着黄连须生长方向，生物碱含量会逐渐减少，因此黄连须离黄连药材较近的部分生物碱含量很高，尤其是黄连素含量更高，而离黄连药材较远的部分黄连须生物碱含量相对较低(表1)。黄连在收获时，连农为了减轻运输量，通常将须根(实际上是离黄连药材较远的部分)丢弃在田中，而离黄连药材较近的部分随黄连一起进入下游加工，最后进入“灰渣”。可见。丢弃在田间的黄连须和叶柄等利用价值很小，黄连灰渣中的须根和柄(桩口)利用价值较高。黄连须目前在市场上的售价不到20元/kg，可利用其价格优势，在黄连短缺时可作为药品生产企业和临床合格的生产黄连生物碱替代品。另外，有研究提到[10]用乙醇回流加热提取，作者经过试验比较认为：乙醇回流提取率工业生产成本高，在经济上不如用浓度为1.5%的硫酸提取合算。该提取工艺也为寻找黄连新药用部位资源提供了理论基础，使黄连生产副产物的大幅度开发利用成为可能。

参考文献：

[1] 明·李时珍著.本草纲目[M].重庆：重庆大学出版社,1995:66.

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[4] 余园媛,王伯初,等.黄连的药理研究进展[J]重庆大学学报,2006,29(2):107-111.

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[8] 席国萍,宋国斌.黄连中小檗碱提取方法研究进展[J]. 贵州农业科学,2009,37(1):8-10.

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[10] 罗音久,曾中良,古淑英.黄连须中盐酸小檗碱的提取工艺研究[J].四川畜牧兽医学院学报, 2002,16(3)：17-20.