细胞自噬的分子机制及其功能

陈兰芳，肖亮综述，杨军平审校

(1、武穴市中医院，湖北 武穴 435300；2、江西中医药大学附属医院检验科，江西 南昌330006)

细胞自噬(autophagy)是真核细胞利用溶酶体对细胞器及蛋白质进行降解的生物学过程[1]，广泛存在于高等脊椎动物的细胞内[2]。自1962年发现后，直到1993年酵母自噬相关基因的发现及酵母突变株模型的建立，细胞自噬的基础研究才有了许多进展[3，4]。 继 2005 年被《Science》预测为年度科技领域的最大热点之后，细胞自噬已经成为生命科学领域最炫目的研究方向。现已证实，细胞自噬在生物体生长发育、细胞分化及对环境的应答等过程中有着关键作用，也与肿瘤的形成、神经性病变、肌病、病原体感染等疾病关系密切[5]。

1 细胞自噬的概述及分类

细胞自噬是一种程序化的细胞内降解过程。细胞通过包裹降解物形成自噬体运送至溶酶体进行消化，以满足代谢需要、细胞器更新及维持细胞稳态[6]。自噬体直径一般为300~900nm，平均500nm,电镜下，其囊泡内常见某些胞浆成份和细胞器如线粒体、过氧化物体等[7]。根据降解物与溶酶体的结合途径不同，可将自噬体分为三类：(1)巨自噬 (macroautophagy):细胞内的可溶性蛋白和某些细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构包裹，并运送至溶酶体，与之结合后降解。巨自噬的双层膜被命名为自噬泡，可能来源于线粒体膜[8]、高尔基复合体膜[9]或内质网膜[10]，但具体形成机制不明[11]，Atg9的多聚化促进了自噬体膜的形成。过去认为，巨自噬体的降解物无明显选择性[12];但有研究表明，某些情况下，蛋白质或细胞器也能被选择性自噬降解，例如线粒体自噬(Mitophagy)、核糖体自噬(Ribophagy)、内质网自噬(Reticulophagy)、过氧化物酶体自噬(Pexophagy)和脂类自噬(Lipophagy)[13]。随着细胞自噬受体蛋白P62的发现，我们更加认识到细胞自噬是一个具有高度选择性的生物过程[14，15]。通常所说自噬即巨自噬。(2)微自噬(microautophagy):细胞通过溶酶体膜直接内陷、包裹细胞内物质(如某些长寿蛋白)并消化、降解。(3)分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)：胞浆中的分子伴侣HSC70能识别底物蛋白分子 (可溶性蛋白分子)的特定氨基酸序列(KFERQ-模式)，当分子伴侣-底物蛋白分子复合物与溶酶体膜上的受 体 LAMP2α (Lysosome-associated memberane protein 2α)结合后，底物去折叠，溶酶体内的另一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位并进入溶酶体内进行降解[16]。

2 细胞自噬的形成过程及分子机制

细胞自噬具有进化高度保守性，它的发生、发展都受多种自噬相关基因的调控。目前，至少已鉴定出30多种自噬特异性基因[17]及50多种相关基因。2003年，以酵母的自噬基因为参考进行了统一命名，以Atg来代表自噬特异性基因及对应的蛋白[18]，哺乳动物自噬相关基因见表1[19]，这些自噬基因编码的蛋白质在自噬的发生、发展的各阶段都发挥着重要的作用。细胞自噬的主要过程包括以下几个阶段(见图1)。

2.1 自噬的启动阶段 正常生理状态下，细胞保持低的基础自噬水平，当细胞在营养和能量缺乏、蛋白质累积、应激状态等情况下，自噬水平会迅速被诱导上调。哺乳动物的自噬诱导主要是通过由ULK1(酵母 Atg1 同系物)、FIP200(酵母 Atg17 同系物)、Atg13三种蛋白形成的ULK1复合物与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)之间相互作用实现的[20]。当能量充足时，mTORC1活化，通过高度磷酸化ULK1和Atg13来抑制细胞自噬。当能量缺乏时，mTORC1活性被抑制，去磷酸化的Atg13与ULK1形成复合物，并与FIP200相互作用，从而诱导自噬体的成核和延伸[21]。成核过程与ClassⅢPI3K(Vps34)-Beclin-1(酵母Atg6同系物)复合物密切相关[22，23]，同在该复合体中的还有调节性蛋白激酶p150(Vps15)以及Atg14的同源分子Atg14L或与Beclin-1和自噬相关的关键性调节蛋白(Barkor)[24],共同作用于膜泡的成核，介导PAS(前自噬体)的形成。Beclin-1-PI3K复合体还可以募集Atg12-Atg5和Atg16L多聚体以及LC3(酵母Atg8同系物)，使后两者促进吞噬泡的伸展扩张[25]。

表1 哺乳动物自噬相关基因

图1 自噬体形成的主要过程

2.2 自噬体的延伸阶段 哺乳动物自噬体的延伸主要依赖于两个泛素化复合系统:Atg12的结合过程与LC3的修饰过程[26]。Atg12的结合过程是类泛素化的过程，需泛素活化酶E1和E2的参与。Atg12首先由Atg7(E1样酶)活化，再通过Atg10(E2样酶)转运至Atg5，后与Atg16结合生成多体复合物,并参与自噬体的扩张[27-29]。

LC3的修饰过程同样需要泛素活化酶E1和E2的参与。LC3前体形成后，被Atg4加工成胞浆可溶性的LC3-Ⅰ，后在Atg7(E1样酶)和Atg3(E2样酶)作用下与磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接成为脂溶性的LC3-Ⅱ-PE，并参与膜的延伸。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合，直到自噬溶酶体(Autolysosome)的形成,因此LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识[30],也是目前唯一发现定位于自噬泡膜上多种信号传导的调节蛋白[31]。

哺乳动物的这两个类泛素化过程，并不是独立运行的，它们之间可以相互作用，相互调节。在哺乳动物细胞HEK293细胞中，Atg3除LC3外，还能与 Atg12 及 Atg12-Atg5 相互作用[32，33],另外，在Atg7的存在下，Atg10的超表达还能促进LC3的修饰[34]。

2.3 自噬体的成熟阶段 自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架，在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体GTP酶(RabS)作用下与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程[35]。参与成熟阶段的溶酶体相关蛋白还包括：LAMP1、LAMP2、UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)等[36，37]。

2.4 自噬体的降解阶段 是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、能量或循环利用。实验表明，部分自噬体蛋白也在降解阶段发挥了重要作用。Atg22直接参与了一部分氨基酸的运输[38]，同时Atg12与Atg15可能参与了自噬溶酶体的裂解[39]。另外，Atg1及Atg13还参与了溶酶体水解酶的运输[40]。

3 细胞自噬调控的分子机制

细胞自噬是一个多步骤调节的过程，信号传导非常复杂，目前人类尚未完全掌握。除了对上述细胞自噬的形成过程中的信号调控有所了解外，另对几条其它信号通路也有了深入的研究和重大进展(图 2)。

图2 细胞自噬的信号调控通路

3.1 mTOR信号通路 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR，是磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶(PIKK)的家族成员。mTOR存在两种不同形式：对雷帕霉素敏感的mTOR复合物1(mTORC1)，包括mTOR、raptor (regulatory-associated protein of mTOR)、mLST8(mammalian ortholog of LST8)、PRAS40(proline-rich Akt substrate of 40 kDa)；另一种对雷帕霉素不敏感的mTOR复合物(mTORC2)，包括mTOR、mLST8、rictor(rapamycin insensitive companion of mTOR)、mSIN1(mitogen-activated protein kinaseassociated protein 1)。mTORC1主要参与细胞生长、细胞凋亡、能量代谢和细胞自噬的调节及各种肿瘤的生长[41，42]。mTORC2参与细胞骨架蛋白的构建和存活，但研究表明，mTORC2也可抑制细胞自噬[43]。mTORC1信号通路是多条信号通路的汇聚点，通过对上、下游信号的来传导影响细胞自噬，现已成为目前研究最多的信号通路。

3.1 .1 mTORC1主要的上、下游信号通路mTORC1的下游通路主要包括：(1)如细胞自噬的诱导阶段所述，mTORC1可以通过对ULK1复合物的磷酸化来调节自噬水平，但ULK1复合物参与自噬的具体调节机制还不明确[44]。实验显示，ULK1复合物的缺失，对自噬的调节并不明显，它的功能可能为其亚型所代偿[45]。(2)mTORC1作用的下游信号分子还包括转录起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、核糖体蛋白S6激酶 (S6K1)等，mTORC1通过与4EBP1、S6K1的相互作用，启动相关基因的转录和翻译，从而调节自噬水平[46，47]。 另外，mTORC1 也可通过与4EBP1、S6K1参与细胞周期的调节[48]。

mTORC1的上游通路主要包括：(1)AMPK-mTORC1信号通路 AMPK的激活能磷酸化结节性硬化症TSC1/2复合物，从而促进mTORC1的失活，诱导细胞自噬水平的提高。TSC1/2复合物是异二聚体，TSC1具有稳定作用，TSC2能抑制mTORC1激活所必须的小GTP酶Rheb(Ras homolog enriched in brain)，实现对mTORC1的抑制作用。AMPK也能直接磷酸化Raptor,抑制mTORC1，上调细胞自噬[49]。(2)I型磷脂酰肌醇3激酶(ClassⅠ PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTORC1信号通路 激活的ClassⅠPI3K能在细胞中产生第二信使PIP3，PIP3在磷脂酰肌醇脂依赖性蛋白激酶1(PDK1)的协助下，激活AKT。激活的AKT能够抑制TSC1/2复合物，从而激活mTORC1,抑制细胞自噬。另外，抑癌基因PTEN(具有磷酸酶活性的张力素同源基因)可以通过抑制ClassIPI3K的活性，诱导细胞自噬水平的上调[50]。(3)Ras/丝裂原蛋白激酶的激酶 (MEK)/细胞外信号调节激酶 Ras-MEK-ERK信号通路在肿瘤细胞中表现活跃，它与细胞自噬的具体机制还仍然待研究。但研究表明，ERK能通过抑制TSC1/TSC2的活性调节细胞自噬水平，促进肿瘤细胞的形成[51]，另外Ras也能通过ClassIPI3K/AKT通路调节细胞自噬。

3.1 .2细胞机体状态的改变对mTORC1的影响(1)细胞能量代谢与mTORC1：mTORC1激酶是细胞能量和营养代谢的感受器。当机体能量缺乏时，AMP/ATP比值升高，继而激活丝氨酸/苏氨酸激酶11(LKB1)-AMPK信号轴，激活的AMPK能磷酸化结节性硬化症TSC1/2复合物，从而促进mTORC1的失活，诱导细胞自噬水平的提高[52，53]。 (2)氨基酸代谢与mTORC1：氨基酸作为细胞自噬的终产物可负反馈调节细胞自噬，同时外源性的支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的摄入也能影响细胞自噬的水平。研究表明，当亮氨酸浓度升高时，能激活mTORC1，抑制细胞自噬[54]，而且ClassⅢPI3K/Vps34也能参与亮氨酸激活mTORC1的通路[55]，但具体机制仍待研究。(3)生长因子与mTORC1:生长因子也可通过mTORC1通路调节细胞自噬。胰岛素样生长因子IGF1 (insulin/insulin-like growth factor)就是通过PI3K/Akt/mTORC1通路调节细胞自噬水平的[56]。IGF1与受体结合后，激活PI3K，并产生PIP3，在磷脂酰肌醇脂依赖性蛋白激酶1(PDK1)的协助下，激活AKT，进而激活mTORC1下调细胞自噬的水平[57]。(4)线粒体的功能与mTORC1:线粒体氧化磷酸化产生的活性氧(ROS)，对mTORC1通路具有双重作用。小剂量的ROS通过ClassIPI3K/AKT信号通路激活mTORC1，但大剂量的ROS能通过AMPK相关通路抑制mTORC1，上调线粒体自噬水平[58]。(5)细胞应激状态与mTORC1:mTORC1激酶也是细胞应对应激状态的一个重要传感器。发育及DNA损伤反应调节基因蛋白1(REDD1)在缺氧和内质网压力时，调节TSC1/TSC2复合物，抑制 mTORC1的活性[59]。

3.2 Beclin-1信号通路 Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，它在自噬的调节、肿瘤的发生发展中发挥重要，是一个重要的候选抑癌基因[60]。Beclin-1蛋白含有BH3(Bcl-2-homology3)、中央螺旋区(CCD)和进化保守区(ECD)三个结构域[61],这些结构域可以与其它因子相互作用，调节细胞自噬水平。

Bcl-2/Bcl-XL都含有BH3受体，能与Beclin-1蛋白竞争性结合，抑制Beclin-1诱导的细胞自噬。另外，死亡相关蛋白激酶(DAPK)能磷酸化BH3结构域，使Beclin-1与Bcl-XL的亲和力减低，上调细胞自噬水平[62]。

Beclin-1可以通过CCD和ECD结构域与ClassⅢ PI3K结合，形成Beclin 1-ClassⅢ PI3KVps15复合体，上调细胞自噬水平[63]。同时这一复合体对细胞自噬水平的调控也受其他蛋白的调节 ， 比 如 Barkor(Atg14L)[64]、Ambra1(activating molecule in Beclin-1 regulated autophagy)[65]和骨髓样分化因子88(MyD88)等。

UVRAG(抗紫外线相关基因产物)，它是酵母Vps38的同源分子，能与Beclin-1的CCD结构域结合，提高Beclin-1与ClassⅢPI3K的相互作用以及ClassⅢPI3K的活性，从而上调细胞自噬的水平[66]。另外 Bif-1[67](Bax-interacting factor 1)和Beclin 1结合蛋白Rubion[68]也能通过UVRAG与Beclin-1相互作用，影响细胞自噬的水平。

3.3 P53信号通路 P53是一个主要的抑癌基因，在细胞周期、细胞凋亡、肿瘤细胞的发生发展过程中都发挥关键的作用。现研究表明P53在细胞的自噬过程中，也发挥了重要的作用。且P53在细胞核和细胞质的不同定位能对细胞自噬产生完全不同的影响[69，70]。 P53在细胞核中：(1)P53能通过sestrin1/2蛋白激活AMPK-mTORC1信号通路，从而抑制mTORC1，上调细胞自噬水平[71]。(2)P53能通过激活DAPK1，磷酸化Beclin-1,促进细胞自噬。(3)P53能通过激活抗凋亡蛋白BCL-2家族(Bad、PUMA、Bax 、BNIP3)，解除 Bcl-2/Bcl-xL 与 Beclin-1之间的抑制作用而上调细胞自噬[72，73]。(4)P53能激活DRAM1(损伤相关自噬调节因子)，通过编码一种溶酶体蛋白，从而上调细胞的自噬水平，但具体机制还未明确[74，75]。

P53在细胞质中有关研究表明，P53缺失的癌细胞中，细胞自噬水平上调，且细胞质中重新载入P53能下调细胞自噬水平[76]。因此，P53在细胞质中能够发挥抑制细胞自噬水平的功能。

部分学者认为，P53在细胞中的不同定位发挥的双重功能以及P53在细胞中的穿梭功能，可能正是P53调控细胞自噬水平的基础。

3.4 其它 除上述三种信号通路外，细胞自噬还存在其它多种信号通路，仍待深入研究。例如：脂多糖 LPS[77]和SSRNA[78]可以通过不同的 Toll like receptors(TLRs)，调节细胞自噬的水平；另外，本实验室也正研究在IL-13和共培养的条件下，细胞自噬中具体的作用和可能信号途径，因有关实验已表明，TH1细胞因子[79]和TH2[80]细胞因子能通过不同的信号通路对细胞自噬发挥不同的调控功能。

4 细胞自噬的功能

4.1 细胞自噬的生理功能 细胞自噬广泛的存在于人体细胞的正常生理过程中，主要功能包括 ：(1)细胞自噬作为细胞内能量的来源，在维持能量代谢及应对应激改变时起着重要的作用。细胞在营养缺乏、应激状态下，通过上调细胞自噬，分解更多蛋白质，来提供细胞存活需要的能量。实验表明，新生的幼鼠在中断胎盘营养供应后，就是通过上调细胞自噬水平维持生存的[81]。(2)细胞自噬在维持细胞稳态中也发挥了关键作用。细胞自噬通过对长寿蛋白、细胞器的降解利用以及清除缺陷蛋白的积聚来参与细胞细胞质的重建和维持细胞稳态。例如：细胞自噬负调控了细胞老化过程中部分蛋白质、细胞器等的积聚，这也提示了细胞自噬与生命长度的相关性[82]。(3)细胞自噬引起的细胞程序性死亡(Ⅱ型程序性细胞死亡[83])，在体内清除无用或病理改变的细胞过程中，起着重要作用。细胞自噬水平的破坏与肿瘤、自身免疫性疾病等关系密切。

4.2 细胞自噬与疾病的关系 (1)细胞自噬与肿瘤大量研究表明，细胞自噬与肿瘤有着非常密切的关系。人类众多癌细胞中都能发现细胞自噬相关基因的缺失，例如Beclin-1在很多乳腺癌细胞中明显表达降低[84]，可见细胞自噬可以抑制肿瘤的发生。但是细胞自噬与肿瘤的关系非常复杂，它在肿瘤的发生发展过程中，扮演着双重角色。在肿瘤发生的早期，抑制细胞自噬可以促进肿瘤细胞的增长，显示细胞自噬可以抑制肿瘤的发生[85]；但是，在肿瘤的进展过程中，细胞自噬却可以抑制肿瘤细胞的凋亡、促进肿瘤细胞的转移[86]从而使肿瘤细胞持续增殖，同时，细胞自噬还能通过促进血管生成来促进肿瘤细胞的生长[87]。另外，在肿瘤的治疗工程中，细胞自噬也有双重功能。一方面，可以保护肿瘤细胞免受化疗、放疗的损伤[88]，另一方面，又可以因为抗肿瘤药物的影响，诱导肿瘤细胞的程序性凋亡。(2)细胞自噬与病原体 进入人体内的细菌、病毒可以被自噬泡包裹运送至溶酶体从而通过细胞自噬降解。 实验表明，细胞自噬相关基因Atg5缺失的的细胞中，A群链球菌可以大量繁殖[89],而且机体可以通过细胞自噬与MHCⅡ类抗原的相互作用，清除进入体内的EB病毒[90]。(3)细胞自噬与神经性退行性疾病、肌病等 细胞自噬广泛参与机体神经元内的异常蛋白的降解，当细胞自噬水平的上调或下调时，可引起神经系统功能障碍 如 Huntington’s[91]、Parkinson’s、Altheimer’s。 另外，肌细胞中，细胞自噬相关蛋白的缺陷，可导致大量自噬溶酶泡的聚集而引起肌病如Danon肌病[92]。相关实验还表明，细胞自噬与糖尿病肾病[93]、心脏疾病[94]也存在重要联系。

5 展望

细胞自噬是存在于真核生物中重要的生理现象，与各种生理活动和疾病息息相关。自发现以来，特别是酵母模型的建立后，细胞自噬的研究取得了突破性的进展；但是，细胞自噬是一个多步骤，极其复杂的过程，在不同的状态、不同的位置、不同的细胞、不同的疾病过程中都存在不同的信号通路和不同的生物功能，它的信号途径和分子机制仍然是一个几十年都未解决的问题。随着科技的进步和社会的发展，细胞自噬越来越成为生命科学领域研究的热点，待细胞自噬研究的深入和发展，我们有望在肿瘤的预防和治疗、生命的衰老等领域取得重的突破。

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