高效液相色谱法测定异喹啉类H-4含量及其有关物质

徐超+杨建云+肖炳坤+黄荣清

[摘 要] 目的：建立高效液相色谱法测定H-4的含量及其有关物质检查的方法。方法：采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相为甲醇-水，线性梯度洗脱（0-25min 35%甲醇→75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇→35%甲醇）；检测波长为236nm，流速1mL/min，柱温40℃；进样体积20μL。结果：有关物质与主峰分离良好，在20～400μg/mL （r=0.9990）线性范围内良好，检测限为0.8ng。结论：本法简单、快速、灵敏、准确，可用于H-4的质量控制。

[关键词] 含量测定；高效液相色谱法

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：2055-5200（2014）01-069-03

Doi：10.11876/mimt201401018

HPLC Determination of Content of Isoquinoline H-4 and its Related Substances

XU Chao1.2， YANG Jian-yun2，XIAO Bing-kun2，HUANG Rong-qing2

（1.Jiangxi university of TCM，Nanchang 330004；2.Academy of military medicine science，Peking 100850）

[Abstract] Objective： To establish a method for the determination of the content of H-4 and its related substances. Methods：RP-HPLC method was established. Column： Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈ （250mm×4.6mm，5μm）；Mobile phase： water-methanol， Linear gradient elution， at a flow rate of 1mL/min with a diode array detector set at 236 nm； the temperature of column is 40℃.Results： Good linearity of the H-4 curve range of 20μg/mL～400μg/mL （r=0.9990）.The limited of detection is 0.8ng.Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive and convenient which can be used to control the quality of H-4.

[Key words] Determination of content； HPLC

1 概述

近年来，环境污染、快节奏的生活规律已让癌症的发病率越来越高，目前已成为世界性的难题。临床上治疗癌症的方法有化疗、放疗、手术，免疫疗法和其他方法 [1]。H-4是新型研发的异喹啉抗肿瘤药物，为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能引起细胞周期阻断和细胞凋亡基因的激活，从而抑制肿瘤细胞的生长[2]。本文采用高效液相色谱法对H-4及其在合成中产生的有关物质进行检测，结果表明，该法灵敏度、精密度和重现性均能满足要求，实验数据准确可靠。

2 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪（waters2695泵，2 9 9 6型二极管阵列检测器，自动进样器，EMPOWER数据处理系统）；BP211D型电子天平（德国SARTORIUS）；甲醇、乙腈为色谱纯（FISHER生产商），水为纯净水（娃哈哈有限公司）；H-4对照品（纯度99.6%），原料药（批号20120715，20120716，20120717）均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供。

3 实验部分

3.1 对照品溶液的制备

取对照品H-4 12mg，精密称量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液。

3.2 供试品溶液的制备

取供试品12mg，精密称量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。

3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱：流动相为甲醇-水，线性梯度洗脱（0-25min 35%甲醇→75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇→35%甲醇），检测波长为236nm；流速1.0mL/min；柱温40℃，进样体积20μL。在该色谱条件下，理论塔板数大于10000，分离度大于1.5，色谱行为良好（如图1）。

4 方法学考察

4.1 线性关系

取对照品约10mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密取对照品贮备液0.5 mL，1.0mL，2.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得一系列浓度的溶液。取上述溶液及贮备液20μL，按“3.3”色谱条件下分别进样两次，记录色谱图。以对照品进样浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，以对照品峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，得线性方程：Y=109261X+899070，r=0.9990（n=7），结果表明H-4在 20μg/mL～400μg/mL范围内具有良好的线性关系。

4.2 检测限与定量限的确定

以信噪比3：1时注入仪器的量为检测限，以信噪比约为10：1时注入仪器的量为定量限。结果H-4的检测限为0.8ng，定量限为3.2ng。

4.3 精密度试验

取3.1项下得对照品溶液，连续吸取6次，每次20μL，以峰面积计算其RSD为0.50%（n=6）。结果表明测定是仪器精密度良好。

4.4 重复性试验

分别精密称取样品（批号20120717）9份，按3.2项下方法操作，配制成浓度为100μg/mL，120μg/mL，150μg/mL的低中高三个浓度，每个浓度溶液制备3份，按3.3色谱条件下测定H-4的含量，平均含量为99.4%，RSD为0.87%（n=9），表明该方法重复性良好。

4.5 稳定性实验

取4.4项下配制好的高、中、低3个浓度的供试品溶液，在0，4，8，12，24，48，72h分别进样20μL，测定峰面积，计算高、中、低三个浓度的峰面积的RSD分别为1.45%、1.21%及0.93%。表明供试品溶液在室温放置72h内稳定性良好。

4.6 样品含量测定

按3.1，3.2项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，分别进样20μL，按外标法以峰面积计算样品含量。实验数据如表1，3批样品H-4含量均在99.0%以上。

4.7 有关物质含量测定

取3.2项下的供试品溶液1mL，精密量取，置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得自身对照溶液。以3.2项下配置的溶液为供试品溶液，按不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量。结果表明，有关物质均在1%以内（见表1）。

5 讨论

5.1 流动相溶剂的优化

流动相是改善分离度的重要参数，分别考察甲醇—水、乙腈—水以及混合溶剂（甲醇乙腈）—水三种流动相对样品的分离。试验表明乙腈—水系统主峰与有关物质峰分离度小于1.5。而混合溶剂（甲醇乙腈）—水则表现出理论塔板数低的缺点。所以最终选择甲醇—水系统。在该流动相系统条件下能较好的改善峰型，且分离度大于1.5，理论塔板数大于10000。

5.2 波长的选择

H-4溶解在甲醇中最大吸收波长为236nm，有关物质也在此波长处有较强吸收；且在此波长处溶剂无干扰，故选择236nm波长为检测波长。

5.3 色谱柱的考察

选择了不同填料、规格及厂家的色谱柱进行比较，包括Phenomenex LUNA C₁₈ Column（250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C₁₈ Column（250mm×4.6mm，5μm）、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈ （250mm×4.6mm，5μm）。结果表明Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈最佳，所得色谱图分离度良好，柱效高，而且相对于其他两类色谱柱，保留时间也有一定的提前。

6 结论

综上所述，该法灵敏度高，重复性好，专属性强，可为H-4样品的质量标准提供可靠的依据。

参 考 文 献

[1] Chi-che Chang， Wei-chuan Chen， Development of natural anti-tumor drugs by microorganisms[J]， Journal of Bioscience and Bioengineering， 2011， 111（5）：501–511.

[2] 谭玉梅，黄文渊.组蛋白去乙酰化酶抑制剂研究[J]，进展药学学报，2009， 44 （10）： 1072？1083.