两种主要钩虫分类鉴定的研究进展

罗 丹(综述)，杨亚明(审校)

(1.大理学院病原与媒介生物研究所普洱分部，云南 普洱 665000； 2.云南省寄生虫病防治所，云南 普洱 665000 )

钩虫是三种主要的土源性线虫之一。在寄生人体消化道的线虫中，钩虫的危害性最严重，可引起钩蚴性皮炎、胃肠功能紊乱、营养不良以及长期慢性失血而导致的缺铁性贫血及与贫血相关的症状。寄生人体的钩虫主要为十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale Dubini，1843)，简称十二指肠钩虫；美洲板口线虫(Necatoramericanus Stiles，1902)，简称美洲钩虫。据卫生部2001～2004年全国人体寄生虫现状调查显示全国31个省钩虫的感染率约为6.12%，推算感染人数约为3930万[1]，2006年全球约有7亿人为钩虫患者[2]，每年由此而损失的伤残调整寿命年高达2210万人[3]。美洲钩虫和十二指肠钩虫在分布、致病力以及对驱虫药的敏感性方面均有差异，例如美洲钩虫和十二指肠钩虫具有不同的地理分布，美洲钩虫在热带环境中占主导地位，而十二指肠钩虫适应干燥寒冷的环境[4-5]；十二指肠钩虫可造成感染者更多的失血[4]；其感染途径除了可经皮肤外，还可经口腔黏膜感染[6]。我国使用阿苯达唑对土源性线虫流行的区域进行大规模驱虫治疗的结果显示，对十二指肠钩虫疗效(92%)显著优于美洲钩虫(69%～75%)[7-8]。因此，鉴别两种钩虫对流行病学、生态学和防治具有重要意义。

1 运用形态学方法进行分类鉴定

1.2幼虫 通称钩蚴，常用试管滤纸培养法[10]将患者粪便中含有的钩虫虫卵经过3～5 d培养，孵育出幼虫经镜检依据美洲钩虫外形：长纺锤形，虫体较短粗，头端略圆，尾端较尖；鞘横纹：显著；口矛：黑色杆状，前端稍分叉，两矛粗细相等，两矛间距窄；肠管：管腔较宽，为体宽的3/5，肠细胞颗粒少。十二指肠钩虫外形：圆柱形，虫体细长，头端略扁平，尾端较钝；鞘横纹：不显著；口矛：透明丝状，背矛较粗，两矛间距宽；肠管：管腔较窄，为体宽的1/2，肠细胞颗粒丰富[10]等形态特征进行虫种的分类鉴别。

1.3虫卵 诊断钩虫感染通常依据人类粪便样本中检出虫卵[11]，然而美洲钩虫卵与十二指肠钩虫卵极为相似，仅从形态学角度观察难以区别[9]。

1.4内镜检查

1.4.1胃镜 常规进镜至十二指肠球部和降部,镜下可见虫体长0.5～1.5 cm的钩虫,活体呈半透明,灰白色、淡红色或暗红色,吸附于肠壁黏膜,呈蛇样盘曲或蚯蚓样蠕动,用活检钳钳夹虫体,虫体来回摆动,虫体吸附处黏膜局部充血水肿可见针尖大小新鲜出血灶呈散在点片状出血，局部少许渗血[12-17]。

1.4.2结肠镜 王声旺等[18]对行胃镜检查，已排除上消化道疾病引起出血的可能，并且十二指肠未发现钩虫的12例患者进行结肠镜检查。其中9例患者首次检查发现钩虫；3例患者在作结肠息肉治疗时在盲肠、升结肠部位发现钩虫虫体。张鸣青等[19]对10例不明原因腹痛、贫血、黑便的患者进行结肠镜检查，此前均进行过胃镜检查，排除上消化道疾病引起出血的可能，4例进行全消化道X线钡餐造影，排除小肠疾病，镜下可见在盲肠处有新鲜出血斑、虫体形态以及活动情况。

1.4.3双气囊小肠镜 Kshaunish等[20]报道了3例表现为黑便患者，经胃镜、结肠镜检查未见出血病灶，经双气囊小肠镜检查，其病因是钩虫感染。付唆林等[21]对反复脐周隐痛伴黑便的患者进行双气囊小肠镜检查，进镜至空肠中下段时可见虫体形态、活动情况以及黏膜损伤情况。

1.4.4胶囊内镜 陈佳敏等[22]报道，使用胶囊内镜检查小肠钩虫病，发现胶囊内镜可以清晰显示虫体的形态、寄生小肠内的分布、活动和进食情况以及肠壁被吸咬后的糜烂创面。常江等[23]报道,胶囊内镜诊断十二指肠钩虫致消化道大出血1例，可见空肠上段附着数条约1 cm长、肉色、半透明的钩虫，呈蛇样盘曲或蚯蚓状蠕动，局部黏膜明显充血，伴散在损伤灶并有渗血。Christodoulou等[24]报道了1例原因不明的消化道出血患者，经胶囊内镜检查诊断为小肠钩虫病，胶囊内镜能显示小肠钩虫感染和吸血情况，是诊断肠道寄生虫病的重要的工具。

2 运用免疫学方法进行分类鉴定

2.1免疫沉淀法 Carr等[25]对体外培养的美洲钩虫成虫的排泄-分泌物，应用免疫沉淀法进行分析鉴定。结果显示，感染该虫的受染人体血清均可沉淀15×103,13×103,33×103,44×103,46×103和69×103的抗原组分。在免疫印迹实验中，受感染动物血清至少可识别15个虫体蛋白质组分，其中包括上述的6个主要组分，而33×103的含量不如排泄-分泌物中的丰富;多个受感染者的血清也能识别33×103抗原组分。这些33×103抗原组分不能为感染蛔虫、鞭虫的个体血清所识别，十二指肠钩虫也无此抗原，表明其具虫种特异性。

2.2SDS-PAGE法 Pritchard等[26]通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylam idegelelectrophoresis,SDS-PAGE)发现所有的钩虫抗原均含有(14～20)×103的多肽组分，而17×103的抗原组分是美洲钩虫所独有的，具有种特异性。(28～33)×103抗原组分，也能被感染了美洲钩虫的患者血清所特异性识别。

2.3ELISA法 在酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)中(28～33)×103抗原组分对于鉴别美洲钩虫与其他蠕虫具有极高的敏感性[26]。

2.4SDS-PAGE法和ELIB法 闻礼永等[27]运用SDS-PAGE和酶联免疫印渍技术(enzyme-linked immunoblotting,ELIB)对采集自动物模型的十二指肠钩虫第三期幼虫可溶性抗原蛋白组分(Ad-L3-Ag)和成虫可溶性抗原蛋白组分(Ad-A-Ag)及免疫反应性进行了研究。SDS-PAGE电泳结果显示,十二指肠钩虫幼虫和成虫蛋白区带数分别为21条和19条。将分带后的Ad-L3-Ag和Ad-A-Ag进行ELIB反应表明,十二指肠钩虫幼虫和成虫特异性抗原组分分别为(40～41)×103和(54～56)×103。

3 运用分子生物学方法

3.1DNA序列测定 李铁华等[28]根据后生无脊椎动物CO1基因保守区域序列,合成上、下游引物，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增采集自四川省合江县的钩虫成虫的CO1基因，并对PCR扩增产物进行DNA测序，结果显示十二指肠钩虫与美洲钩虫CO1基因序列同源性达89.7%，存在10.3%的特定核苷酸差异，并证明该核苷酸序列的差异是稳定的，可作为两种钩虫鉴定的标志。

3.2分子标记 郑琪等[29]根据NCBI数据库中美洲钩虫CO1基因和十二指肠钩虫CO1基因的序列分别设计出美洲钩虫种鉴别正反两条PCR扩增引物NaF-NaR，十二指肠钩虫种鉴别正反两条PCR扩增引物AdF-AdR，对采集自福建、贵州、四川、海南和广西五省钩虫成虫的CO1基因进行扩增，结果显示以五省的美洲钩虫DNA为模板的PCR扩增均可获得一条长约500 bp的条带，以五省的十二指肠钩虫DNA为模板的PCR扩增均可获得一条长约700 bp的条带，特异性检验显示两对引物具有较好的特异性，构建特定的引物作为分类鉴定两种钩虫的分子标志物是可行的。

3.3实时荧光PCR 汪家旭等[30]和Wang等[31]将采集自福建省厦门市海沧区农村的人粪便标本在27 ℃恒温条件下孵化，收集钩蚴，在根据GenBank中美洲钩虫的ITS-2序列设计特异性引物,提取幼虫虫体基因组DNA,进行PCR扩增ITS-2序列、克隆、测序和比对，实验获得的美洲钩虫rDNA ITS序列经对比与数据库中的序列完全一致；利用常规PCR依次以美洲钩虫、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、犬钩虫(Ancylostoma caninum) DNA和水为模板检验引物的特异性，结果显示无PCR产物产生证明引物的特异性良好；将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5a,提取重组质粒,鉴定后作为标准模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏度和重复性实验，结果显示各溶解曲线为单一吸收峰,产物专一；实时荧光PCR特异性实验结果美洲钩虫检出了明显的扩增曲线,而其余模版未检出荧光曲线,表明所设计的美洲钩虫实时荧光PCR检测引物能特异性检测出美洲钩虫DNA；实时荧光PCR可以检测200 mg粪便中仅含有1个虫卵，灵敏度比常规PCR至少可高100倍；变异系数<3%,表明荧光PCR检测方法具有较高的可重复性；为美洲钩虫的鉴别以及快速、灵敏、定量检测提供了技术支撑。

4 三种分类方法的优缺点评述

以上综述的方法中运用形态学方法对两种钩虫进行分类，所需仪器设备及操作方法相对比较简单，但这种方法可靠性不强，而且要求检查者具有丰富的经验并且熟练掌握两种钩虫成虫及幼虫的体态特征[32]，对待检样本也有较高要求，对于轻度感染患者，驱虫后获取的虫体较少或虫体破损等均会影响检查者的判断；培养幼虫则需要耗费时间；而对于虫卵仅从形态学不能进行虫种鉴定。而运用免疫学方法，由于其抗原特异性欠佳,作为虫种鉴定的可行性没有确切的文献证实，没有得到广泛应用。现阶段分子生物学技术被广泛应用到寄生虫学与寄生虫病研究领域，其中PCR技术因其操作简便、敏感性高、特异性强和信息量丰富等优点[33]，弥补了形态学分类上的不足和难以鉴别而得到了广泛应用。运用分子生物学方法可以用于鉴别从形态学无法确定的残损虫体及不典型的钩虫成虫，同时也避免了免疫学方法易发生交叉反应的情况，仅用小部分成虫虫体即可成功制备DNA并扩增出目的条带用于鉴定美洲钩虫和十二指肠钩虫且准确性较高；但此方法对仪器设备有一定的要求，并且现有文献仅证实用此方法可对两种钩虫的成虫和钩蚴进行分类鉴定，而对于虫卵是否有效还有待于进一步探讨证明。

5 结 语

随着科学技术的发展许多传统方法由于自身缺陷无法满足现代医学的需要，促使人们寻找新的、快速准确的工具进行诊断和防治，而鉴定虫种可以评估驱虫药物对两种钩虫相应的疗效，可以了解不同地区的优势钩虫虫种，再选择合适的驱虫药物从而取得更好的药物经济学效益[34]。此外，钩虫虫种的鉴定可以对监控钩虫的流行状况也非常重要，能够提供疾控部门两种钩虫在干预措施下的流行病学资料，评估疾病干预的效果等，对于钩虫病的研究具有重大意义。

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