大白菜FAD8基因的转录调控研究

刘春香,潘 爽,薛 瀚,刘福

(潍坊学院 山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室,山东 潍坊 261061)

FAD8基因是1994年在拟南芥中首次发现的，功能是催化二烯脂肪酸(亚油酸和棕榈二烯酸)转变为三烯脂肪酸(TAs，亚麻酸和棕榈三烯酸)[1]；FAD8是一个在质体中表达的脂肪酸去饱和酶，相同功能的酶在拟南芥中共发现3个，FAD3[2]、FAD7[3]和FAD8，其中FAD7和FAD8的表达部位都是质体，主要影响类囊体膜脂的组成，在拟南芥中FAD8的表达表现出低温诱导特性，被称为低温诱导的脂肪酸去饱和酶[1]。FAD8除了与低温有关外，还参与的茉莉酸[4]、ABA和SA[5](水杨酸)介导的抗病防御反应，在烟草中的FAD8还表现出抗干旱胁迫的功能[6]，玉米的FAD8还表现出盐胁迫的抗性[7]。

大白菜对低温有较强的抗性，我们关注并克隆了BcFAD8(Bc代表大白菜)基因[8]，其是否在抗低温过程中显示了重要功能呢？另外，植物抵抗低温的重要特征是膜脂不饱和度的增加[9]，膜脂去饱和的分子机制主要是脂肪酸去饱和酶调节的，该家族的酶又受一系列因素的调控[10]，BcFAD8又受哪些因素调控呢？为此，我们对大白菜进行了低温处理，分析BcFAD8的表达，令笔者不解的是，多次的低温处理并没有检测出温度与BcFAD8转录水平变化的相关性，其表达与低温诱导无关吗？为解决这一疑问，我们对BcFAD8上游的启动子及调控序列进行转录因子结合元件分析，并通过实时荧光定量PCR检测BcFAD8的表达，来探究该基因的表达模式，为进一步研究其在逆境中的生理功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 大白菜的低温处理及电导率、叶绿素荧光参数测定

在秋季进行大白菜播种，先在无草苫覆盖的日光温室内盆栽培养约2个月，到冬季达到莲座期转移到室内，适应几天后放入培养箱内进行变温处理。将大白菜分为2组(以20 ℃)为起点，一组从20 ℃开始降温，分别在15 ℃、10 ℃、5 ℃、0 ℃下进行培养；另一组从20 ℃开始升温，分别在25 ℃、30 ℃下进行培养。每个温度下培养3 d(光照16 h，黑暗8 h)，然后取生长旺盛的叶片，每个处理3次重复，按照陈建勋等[11]的煮沸法测定电导率，并计算相对电导率。叶绿素荧光参数采用德国PAM2100叶绿素荧光仪测定，样品处理方法与电导率测定时的处理方法相同，测定前先对叶片进行30 min的暗适应，分别对Fmin(最小荧光值)、Fmax(最大荧光值)进行测定，每个处理3次重复。

1.2 PCR引物设计及基因克隆

BcFAD8基因在Genebank上的登录号为AY894813.2，通过序列特异性比对，选择特异性序列区段，设计用于表达定量的PCR引物，上游引物P-s1：GGGTTGGACTTTGTGAC，下游引物为P-a1：GCCTTGTTTGTTACAGTC，扩增序列位于终止密码子前。内参为大白菜β-actin基因，其上游引物为actin-ps：CACTTCTCCTCCTTCTTTGG，下游引物为actin-pa：TAGGCATCCTT CTGGTTCA。引物由生工生物技术服务有限公司合成。根据BcFAD8上游序列和大白菜基因组的Bac克隆 KBrH034G13序列，设计引物，上游引物P1 CAACCCAAAACGAGAACAGT，下游引物P2位于BcFAD8基因起始密码子附近，序列为TCACCAATCTAGCACTATCACTG，扩增目的片段长度1 069 bp，PCR扩增程序为预变性94 ℃、8 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、80 s，30个循环，后延伸72 ℃、5 min，扩增产物用1%琼脂糖电泳，目的片段采用天根的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，并克隆到pMD18-T载体上，阳性克隆送山东省农业科学院测序中心进行测序。

1.3 BcFAD8基因的半定量PCR表达部位检测分析

基因表达组织特异性半定量PCR样品为冬季温室内生长正常的大白菜根、茎、叶，采用Trizol法提取总RNA，用快速核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，做反转录模板，RNA量每管1 μg，反转录总体积10 μL。为选择适当的循环数，对扩增22、24、26、27、28个循环的产物分别进行电泳检测，最终确定为28个循环。内参基因和BcFAD8基因表达检测的反应程序均为94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，51 ℃、30 s，72 ℃、30 s，28个循环，采用20 μL的反应体系。扩增后的产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.4 BcFAD8基因的实时荧光定量检测

对培养20 d左右生长正常的大白菜样品进行低温处理，起点温度为25 ℃；每隔3 h变化1次温度，温度间隔5 ℃，降到5 ℃以后，再以5 ℃为起点，同样的方式升高到25 ℃。采用TaKara公司的RNAiso Plus试剂盒提取叶片总RNA，反转录采用TaKara公司的反转录试剂盒，每样品反转录1 μg总RNA，PCR反应时每管取1 μL，内参和目的基因同时做定量PCR，重复3次，反应体系25 μL，循环40个，引物同半定量PCR，反应程序94 ℃、 2 min，94 ℃、30 s，51 ℃、30 s，72 ℃、30 s，采用伯乐荧光定量PCR仪，用SYBR Green Ⅰ检测体系，相对定量2-△△CT方法，系统自动计算表达量差异并生成基因表达差异图。

1.5 BcFAD8基因的启动子及调控序列分析

利用PlantCARE软件( http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be /webtools /plantcare /html /) 对BcFAD8的启动子区进行分析，标出各种类型的顺式作用元件。

1.6 黑暗光照、ABA、SA处理后BcFAD8基因的荧光定量检测

对大白菜两叶一心期的幼苗进行处理：(1)在培养箱内遮光黑暗处理2 d，见光1.5 h后取样；(2)正常见光大白菜叶面喷施100 μmol/L的SA，分别于1.5 h、3 h后取样；(3)正常见光大白菜叶面喷施100 μmol/L的ABA，1.5 h、3 h后取样。对所取的新鲜叶片进行液氮短期保存，并提取总RNA，进行荧光定量PCR分析，方法同上。

2 结果与分析

2.1 低温处理后大白菜叶片电导率的变化

电导率是反应细胞膜完整性的参数，测得的变温处理的大白菜叶片的相对电导率变化见图1。从图1可知，经过低温环境培养的大白菜，进行不同温度的处理，相对电导率0 ℃时最低，大白菜的膜基本未见损伤，随着温度的升高，大白菜膜的渗透性变大，电导率在常温下较高，30 ℃高温下膜的损伤较大，渗透性明显升高，相对电导率达24%以上。

图1 变温处理大白菜叶片相对电导率变化

2.2 低温处理后大白菜叶片叶绿素荧光参数的变化

Fmin是反应叶绿体不能进行光化学反应的荧光值，该值的升高代表不用于光合作用的光能增多，正常状态下Fmin值越小越好，而Fmax值表示用于光合作用的最大光化学效率，Fmax值越大越好，在逆境下往往因光合器官受损Fmin值升高，Fmax值下降。本研究从20 ℃到0 ℃的降温处理过程中，Fmax值未见明显变化，Fmin值也基本未升高，说明0 ℃及以上低温对叶绿体功能未造成损伤(见图2，图中F为相对值)；而从20 ℃到30 ℃的升温过程中，大白菜的Fmin值变化不大，Fmax值明显降低，说明高温对大白菜叶绿体有一定的损伤。从大白菜叶片整体生长状况也可以得知，30 ℃下生长几天后叶片开始变黄，其他温度下都基本保持深绿色。

图2 变温下大白菜叶片Fmin和Fmax值的变化

从电导率变化和叶绿素荧光参数变化可知,高温下叶绿体受到了一定损伤，低温下则没有，说明大白菜叶绿体对低温具有适应性。

2.3 BcFAD8基因表达的组织特异性

用半定量RT-PCR方法对BcFAD8基因在大白菜不同器官的表达进行了分析(见图3)。结果表明，BcFAD8基因在大白菜茎、叶中表达，以叶中的表达亮度最高，在根中基本不表达，说明该基因在绿色组织里表达。

图3 BcFAD8在不同器官中的表达

2.4 低温处理下BcFAD8基因的荧光定量分析

低温处理下BcFAD8基因的荧光定量结果见图4。从图4可以看出，温度升高处理时，各温度处理间没有明确的变化趋势，表达量最大差异0.68倍，这一差异在基因表达水平上是较小的；温度降低处理时，各温度下BcFAD8基因的表达也没有明显差异，表达量差异最大1.07倍，与系统误差的水平相当，而且表达变化没有规律，25 ℃和5 ℃基本保持相当的水平，说明基因表达量没有随着温度的下降而升高，BcFAD8基因表达的平均水平均高于β-actin基因表达的平均水平。

图4 低温处理下BcFAD8基因的荧光定量分析

2.5 BcFAD8基因启动子克隆及调控序列的元件分析

为确定大白菜基因组的 KBrH034G13克隆中含有BcFAD8的启动子区域，确保起始密码子上游没有内含子间隔，我们通过PCR扩增了从起始密码子到-1 061处的序列,见图5。结果表明，获得了大于1 kb的目的片段，经克隆测序，通过序列比对证明得到的序列与KBrH034G13的序列一致。说明可以利用KBrH034G13的信息分析BcFAD8的启动子序列。

对BcFAD8基因起始密码子上游1 500 bp范围内的表达元件分析，可以发现除了启动子起始必须的TATA框、起始子和CAAT框以外，该基因还有多个表达调控元件(见表1)。由于功能与叶绿体膜脂有关，故含有多个光响应元件，共13个。还有胁迫应答元件5个，生物钟元件3个，激素响应元件4种8个。此外，未标注的还有5个胚乳表达相关元件和一些蛋白因子结合位点，以及一些功能未报道的元件，未发现温度响应元件。基因表达的调控是复杂的，仅从元件分析并不能准确证实各种因素可以诱导该基因的表达。

图5 BcFAD8启动子区的PCR扩增

表1 BcFAD8基因启动子上游的主要顺式作用元件

表1(续)

2.6 部分启动子调控元件的有效性验证

采用荧光定量PCR对几个代表性元件进行检验，结果见图6。当大白菜从黑暗转到光照1.5 h后，叶中FAD8基因表达上调12.5倍，说明光照能够诱导该基因的大量表达。水杨酸(SA)对基因的诱导有延迟效应，在处理1.5 h后基因表达量有所增加，与对照(CK)相比并不明显，表达上调1.2倍；但在处理3 h后，基因表达量明显增加，3 h处理与对照的表达差异为4.7倍。ABA对大白菜叶片的FAD8表达的影响效果明显，在喷施ABA1.5 h后，基因表达量明显增加，与对照的表达差异为12.2倍，处理3 h后比对照增加12.6倍，说明ABA对BcFAD8的诱导快；而SA诱导具有延迟效应。从上述结果可知，光照、SA、ABA对BcFAD8都有诱导表达的效应，说明元件分析的结果在实验分析中能够得到证实，BcFAD8基因受多种信号调控。

3 讨论

从本研究的结果看，大白菜对0 ℃以上的低温是适应的，膜系统并未产生损伤；相反，在温度逐渐升高的过程中，表现出了相对电导率的升高，叶片变黄，说明在适应一段时间的低温后，0 ℃及0 ℃以上的低温不会损伤大白菜膜系统。Routaboul J M等[12]的研究表明，植物体内类囊体膜含有的TAs比其他部位高，生长在22 ℃的拟南芥含有约70%的类囊体TAs，大白菜可能也是由于类囊体膜TAs含量高导致其低温耐受性。Vijayan P(2002)[13]报道降低类囊体膜脂不饱和度会产生光抑制，类囊体膜上的TA对低温下解除光系统II失活是必须的。本实验低温下大白菜叶片保持深绿色，生长良好，Fmin和Fmax参数均处于最佳状态，推测其叶绿体膜系统有较高的TAs水平，应该具有较高的FAD酶活性。本研究低温处理并没有提高BcFAD8的表达水平，这与Falcone D L[14]、Shah S[15]、Gibson S等[4]对拟南芥的报道，Berberich T[8]对玉米的报道不一致，可能FAD8本身的转录水平已经足够高了，或者存在其他低温诱导表达的同功能FAD基因代偿了FAD8，也可能存在转录后水平的调控。ángela Román[16]报导大豆的FAD3B的转录不受低温诱导，且高温下存在蛋白降解水平的调控。

图6 荧光定量PCR对BcFAD8基因经光照、水杨酸处理和ABA处理后的检验结果

膜脂随温度升高，饱和度升高是适应温度的必要调控[17]，那么如何通过降低ω-3脂肪酸去饱和酶来降低TAs的含量呢？拟南芥的FAD8蛋白存在热不稳定的44个氨基酸的碳端结构，温度升高后会加速酶蛋白的降解[2]，BcFAD8在转录水平基本不受温度影响，可能与拟南芥FAD8一样，存在转录后蛋白降解水平的调控。

对于高温下BcFAD8也能正常表达，我们推断TAs对植物的作用远不止是膜不饱和度的增加。Routaboul J M[12]发现长期在高温下缺乏TAs植物也会死亡，膜脂中一定比例的TAs是必需的。TAs中的亚麻酸是茉莉酸的合成前体[5,18]，与维生素E代谢有关[19]，有清除活性氧的生理作用[20]。因此要维持质体中一定水平的TAs含量，必须保证FAD8或同功能基因持续表达。

基因的表达受各种因素诱导调控，因此在基因的启动子上游必然存在相应的调控元件，本研究分析了BcFAD8的调控元件，发现该基因受光照、激素、逆境等多种因素诱导，说明该基因的转录水平调控是复杂的。本研究发现，黑暗下BcFAD8转录水平很低，光照可明显提高BcFAD8的表达水平，这与大豆FAD8有相同的调控机制[21]。根中不表达可能是因为根不见光，或不含叶绿体。SA和ABA处理也提高了BcFAD8的表达，与启动子元件预测的结果相同。且前人的报道也证实该基因与植物抗性[8]有关，关系到SA[22]、ABA[12，20]等信号的调控。我们在启动子序列分析中没有发现低温响应元件，结合表达定量分析结果，我们认为BcFAD8不是低温诱导后转录水平升高的基因，对于喜冷凉的物种，大白菜可能一直保持较高的BcFAD8转录水平，其响应环境高温可能存在转录后水平的调控。

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