葡萄渣单宁对绵羊养分消化代谢及瘤胃发酵的影响

赵栋，郑琛，2＊，李发弟，2，李冲，2，李廷福

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室，甘肃 民勤733300；3.民勤中天羊业有限公司，甘肃 民勤733300）

葡萄渣主要是葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗等，是葡萄加工或葡萄酒生产过程产生的下脚料［1－2］。营养价值丰富，可作为非常规饲料开发利用。我国是葡萄生产的大国之一，2009年全国产葡萄794.1万t，其中约40%用于酿酒，葡萄酒生产过程中约产生60万t葡萄渣。葡萄渣集中于生产过程，易于收集和贮存，在饲料上的利用优势明显。近年来有较多葡萄渣综合利用的研究报道，但主要集中于其有效成分提取工艺和生物活性的研究，作为一种非常规饲料报道较少。

对瘤胃微生物生态系统的调控能够增加瘤胃发酵的效率，并最终提高动物生产性能是动物生产的主要目标。含有精油、单宁、皂苷、黄酮和许多其他植物次生代谢物的植物或植物提取物被证实能改善瘤胃代谢，如降低甲烷产量和瘤胃蛋白质的降解、增加微生物蛋白质的合成和瘤胃微生物蛋白流向十二指肠［3］。葡萄渣含有丰富的粗蛋白质、粗脂肪、无氮浸出物和矿物质［4］，其缩合单宁含量为21～36g/kg DM［5］。单宁是植物中存在一类复杂的多酚类次生代谢物，包括缩合单宁（condensed tannin，CT）与水解单宁（hydrolysable tannin，HT）。单宁的化学性质活泼，易与蛋白质结合，因此一直被认为是饲料中的抗营养因子。然而，研究发现反刍动物采食缩合单宁含量较高的饲草后，由于过瘤胃蛋白数量增加而提高蛋白质的利用效率［6］。目前人们仅认识到单宁对饲料蛋白质具有保护作用，但对绵羊的具体应用方法和剂量仍不明确。本研究选用已知缩合单宁含量的葡萄渣，通过消化代谢试验测定饲粮中不同含量葡萄渣单宁对绵羊养分消化代谢及瘤胃发酵的影响，旨在为提高饲粮中蛋白质的利用效率、合理有效地利用现有饲料资源和葡萄渣的开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

于2012年12月－2013年4月在甘肃农业大学动物科学技术学院动物训练中心及动物营养实验室进行。

1.2 试验材料

选用石羊河葡萄酒厂的鲜葡萄渣，自然干燥后用植物粉碎机粉碎，过1.0mm筛后用自封袋封装保存备用。

1.3 试验设计

采用4×4拉丁方试验设计，每期试验17d，其中预试期10d，正试期7d。试验设4个饲粮处理，处理1为不含葡萄渣的基础饲粮，处理2至处理4分别为含5%，10%和15%葡萄渣的饲粮，各处理的缩合单宁含量分别为0.00，0.85，1.70和2.25g/kg DM。

1.4 试验动物及饲养管理

选取4只身体健康且安装永久瘤胃瘘管羯羊［萨福克（Suffolk）♂×小尾寒羊（small tail Hanyang）♀］，年龄约2.5岁，体重28kg左右。绵羊单笼饲养，每只绵羊每天饲喂1kg饲料。在过渡期每只绵羊均饲喂基础饲粮，每日8：00和16：00两次等量饲喂，准确记录每只绵羊采食量。绵羊自由饮水。预试期及正试期按照试验设计饲喂试验饲粮，饲喂方式和饲养管理制度不变。

1.5 试验饲粮配方

参照中国肉羊饲养标准（NY/T 816－2004）中体重30kg、日增重0.1kg/d的育成公绵羊营养推荐量配制试验饲粮（表1）。

表1 试验饲粮配方及营养成分Table 1 Composition and nutritional levels of diets

1.6 样品的采集及处理

每期试验的正试期采集饲粮、粪样和尿样。正试期最后1d在食前及食后2，4，6和8h从绵羊的瘘管中抽取50mL瘤胃液，立即测定瘤胃液的pH值，然后用4层纱布过滤，收集于采样瓶中，并加入1mL饱和HgCl2溶液使酶灭活，放入－20℃冰箱冷冻保存。

饲料、粪、尿中干物质，粗蛋白质，中性洗涤纤维，酸性洗涤纤维，钙和磷的测定采用常用方法［8］；瘤胃液pH用Sartorius PB－10型酸度计测定；瘤胃液氨氮采用冯宗慈和高民［9］改进后的比色法测定；瘤胃液尿素氮采用二乙酰一肟法测定（试剂盒购自南京建成生物工程所）；饲料和粪样中的能量采用XRY－1C真空弹微电脑自动热量计测定；瘤胃液挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）采用气相色谱法（安捷伦6890N气相色谱仪）测定。

1.7 统计分析

试验数据用SPSS 16.0统计软件进行拉丁方方差分析，差异显著时，采用Tukey法进行多重比较，并用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 绵羊养分表观消化率

处理4绵羊对饲粮氮的消化率极显著高于处理2绵羊（P＝0.007）且显著高于处理1绵羊（P＝0.019），处理3绵羊对饲粮氮的消化率显著高于处理2绵羊（P＝0.046）；处理4绵羊对饲粮氮的存留率显著高于其他各组绵羊（P＝0.012，P＝0.016，P＝0.025）。其余差异不显著（P＞0.05）（表2）。

2.2 绵羊瘤胃内氮浓度

处理1绵羊瘤胃液中总氮浓度极显著高于其他各处理绵羊（P＝0.003，P＜0.001，P＜0.001）；处理1绵羊瘤胃液中蛋白氮浓度极显著高于处理3绵羊（P＝0.001）且显著高于处理4绵羊（P＝0.017）；处理4绵羊瘤胃液中尿素氮浓度极显著高于处理2和3绵羊（P＝0.003，P＜0.001）并显著高于处理1绵羊（P＝0.030）。其余差异不显著（P＞0.05）（表3）。

表2 绵羊养分表观消化率及氮存留率Table 2 The apparent digestibility of nutrients and nitrogen retention of sheep %

表3 绵羊瘤胃液中氮浓度Table 3 Nitrogen concentration in ruminal fluid of sheep mg/100mL

处理1，2和3绵羊瘤胃液中总氮浓度动态变化趋势基本一致（图1a），采食后总氮浓度下降，食后4h降至最低值后逐渐升高，处理4绵羊瘤胃液中总氮浓度食后2h降至最低值后逐渐升高（图1）；4个处理绵羊瘤胃液中氨氮浓度动态变化趋势基本一致（图1b），食后2h氨氮浓度升至最高值后逐渐降低，在食后6h降至最低值然后升高；处理1，2和3绵羊瘤胃液中尿素氮浓度在食后下降（图1c），处理1和3在食后4h降至最低值后升高，处理2在食后6h降至最低值后升高，处理4绵羊食后尿素氮浓度升高，在食后2h升至最高值后下降，食后4h降至最低值后升高；4个处理绵羊瘤胃液中蛋白氮浓度动态变化趋势基本一致（图1d），处理1，3和4在食后2h降至最低值，处理2在食后4h降至最低值，然后升高。

2.3 绵羊瘤胃液pH及挥发性脂肪酸浓度

处理4绵羊瘤胃液中丙酸摩尔比极显著高于处理1和2绵羊（P＜0.001，P＝0.003），处理3绵羊瘤胃液中丙酸摩尔比极显著高于处理1绵羊（P＝0.009）；处理1绵羊瘤胃液中丁酸摩尔比和乙丙比极显著或显著高于处理4和处理3绵羊（P＝0.006，P＝0.034；P＝0.001，P＝0.031），处理2绵羊瘤胃液中乙丙比显著高于处理4绵羊（P＝0.028）。其余差异不显著（P＞0.05）（表4）。

食后各处理组绵羊瘤胃液中pH、总挥发性脂肪酸及乙酸、丙酸、丁酸摩尔比和乙丙比动态变化基本一致（图2）。食后各处理绵羊瘤胃液pH逐渐下降（图2a）；食后各处理绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸升高（图2b），在食后4 h升至最高值后下降；食后各处理绵羊瘤胃液乙酸摩尔比和乙丙比升高（图2f），食后2h或食后4h升至最高值，然后下降；食后各处理组绵羊瘤胃液丙酸和丁酸摩尔比下降（图2d，e），食后2h或食后4h降至最低值，然后升高。

图1 绵羊瘤胃氮浓度参数动态变化Fig.1 Dynamic changes of nitrogen concentration in ruminal fluid of sheep

表4 绵羊瘤胃液pH、总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度及各种酸的摩尔比Table 4 The pH，total volatile fatty acids and molar ratio of each acid to total volatile acids in ruminal fluid of sheep

3 讨论

3.1 绵羊养分表观消化率

Barry和Forss（1983）［10］在试验中给绵羊饲喂长柄百脉根（Lotuscorniculatus），发现随着缩合单宁浓度的上升，有机物和纤维素的瘤胃降解率均呈下降趋势。单宁对反刍动物消化过程的影响很复杂。单宁结构中的大量酚羟基团和芳香环基团与饲料以及动物体内的蛋白质或酶的肽基、氨基以及羧基等以氢键的形式多位点结合，形成不易消化的复合物使肠道微生物对氮的有效利用率下降，导致饲料中养分的消化率下降。Khazaal和Orskov（1994）［11］在对各种不同缩合单宁含量牧草进行体外试验时，发现单宁浓度与体外干物质降解率呈负相关。本试验中，葡萄渣单宁对饲粮干物质、有机物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙和磷的表观消化率均没有产生显著的影响，可能与单宁浓度及来源有关，因为不同来源单宁对养分降解率的影响存在显著差异［8］，而且这也说明本次试验中采用的缩合单宁浓度还不能对养分表观消化率产生显著影响。

图2 绵羊瘤胃参数动态变化Fig.2 Dynamic changes of parameters in ruminal fluid of sheep

本次试验中，处理4绵羊的氮表观消化率显著高于处理2和处理1绵羊，且氮存留率显著高于其他各组绵羊，可能与提高绵羊过瘤胃蛋白及降低尿氮排出有关。单宁－蛋白质复合物在瘤胃内不易降解，会提高粗蛋白质的过瘤胃率，虽然可能因此而降低瘤胃微生物合成效率，但饲粮粗蛋白质利用率高时，可通过降低尿氮排出而提高机体氮存留率。Cortés等（2009）［12］的研究也发现，将从朱樱花（Calliandrahaematocephala）、大叶千斤拔（Moghamiamacro－phylla）和银合欢（Leucaenaglauca）中提纯的缩合单宁按照0，300，600，900mg/g豆粕粗蛋白质的比例添加到豆粕中后，干物质和粗蛋白质的体外降解率极显著降低且过瘤胃蛋白含量提高。张晓庆等（2010）［13］的研究也证实，红豆草（Onobrychisviciaefolia）单宁可通过显著降低绵羊尿氮排出而提高氮存留率。

3.2 绵羊瘤胃内氮浓度

反刍动物瘤胃液中的总氮包括氨氮、尿素氮、饲料中可溶解的蛋白氮以及菌体蛋白氮等，饲粮粗蛋白质含量和降解率对瘤胃液总氮有直接影响［14］，其中，氨氮浓度是反映反刍动物瘤胃内氮降解的最重要指标。氨氮是反刍动物瘤胃内肽、氨基酸、氨化物、尿素和其他非蛋白氮化合物分解的终产物，同时又是微生物合成菌体蛋白的原料，反映饲粮蛋白质的含量、其瘤胃降解特性和微生物的合成状况［15］。本试验中，各处理绵羊瘤胃氨氮浓度无差异的情况下，处理1绵羊瘤胃液总氮浓度极显著高于其他各组绵羊，说明单宁在抑制饲粮粗蛋白质降解的同时对瘤胃微生物合成也存在负面影响，从而导致氨的积累。Wang等（2007）［16］曾报道，利用红豆草干草饲喂绵羊时导致绵羊瘤胃氨氮浓度显著降低，这可能与不同试验中单宁浓度与来源不同有关，本试验中该浓度的葡萄渣单宁对瘤胃微生物的影响更为明显。本次试验中，各处理绵羊瘤胃总氮和氨氮浓度从食前至食后8h的变化规律基本一致，且符合反刍动物瘤胃氮浓度变化的一般规律，因为王桂瑛等（2005）［17］认为，采食为微生物提供了必需的营养，较强的咀嚼和反刍作用使精料中的蛋白质不断的降解释放，同时使粗料中的细胞可溶性物质不断的溢出，使氨氮浓度迅速增至峰值，随着在瘤胃内被微生物的利用和瘤胃壁的吸收，氨氮浓度逐渐下降，在下次采食后会出现回升现象。

瘤胃液尿素氮浓度受饲料内尿素氮含量及其溶解速度、唾液分泌及经瘤胃壁吸收入血液的氨态氮浓度的影响。本试验中，处理4绵羊瘤胃液中尿素氮浓度显著高于其他处理绵羊，可能与单宁的涩味刺激唾液分泌并使较多再循环尿素进入瘤胃有关［18］，但处理2和3绵羊瘤胃液尿素氮浓度却没有呈现出相同变化规律，是否与单宁含量存在相关，还需要做进一步研究。

瘤胃液蛋白氮包括饲料蛋白氮中可溶解部分，微生物蛋白氮及唾液蛋白氮。瘤胃液蛋白氮可反映瘤胃中氨被瘤胃微生物利用的状况［19］。而饲粮中的可降解蛋白是合成微生物蛋白的主要氮源。本试验中，单宁的添加显著降低了绵羊瘤胃液蛋白氮浓度，与单宁抑制饲粮粗蛋白质在瘤胃中降解的结果相符，此外，由于单宁对瘤胃微生物产生的不利影响，最终导致瘤胃液蛋白氮浓度显著降低。

3.3 绵羊瘤胃液pH及挥发性脂肪酸

瘤胃液pH是反映反刍动物瘤胃综合发酵水平的重要指标，它主要受到饲粮性质、有机酸积聚和唾液分泌量等因素影响［20－21］。Murphy和 Kennelly（1987）［22］与韩正康和陈杰（1988）［23］指出，瘤胃内 pH 值变动范围为5.0～7.5，呈有规律形式变动，取决于饲粮性质和摄食后时间，一般于饲喂后2～6h达最低值。本试验各处理绵羊瘤胃液pH值随时间的变化趋势大致相同，也都处于正常变动范围。

饲料中的碳水化合物是动物机体能量的主要来源，而在反刍动物瘤胃中，有55%～95%的碳水化合物经瘤胃微生物的降解，生成葡萄糖、果糖、木糖等己糖和戊糖，经酵解转化成丙酮酸后，进一步分解成挥发性脂肪酸和ATP［24］。乙酸、丙酸和丁酸浓度的相对比例不仅受反刍动物采食水平的影响，而且也受饲粮组成等因素的影响［25］。本试验中，单宁对绵羊瘤胃液总酸浓度和乙酸摩尔比没有产生显著的影响，但显著提高丙酸摩尔比而显著降低丁酸摩尔比和乙丙比，这可能与单宁抑制瘤胃微生物活性有关，因为粗饲料降解慢于精饲料，粗饲料降解抑制会导致乙酸摩尔比降低更多，导致丙酸摩尔比相对升高而乙丙比相对降低。Ngsmdscng（2006）等［25］用体外法研究多种植物的发酵情况，结果发现缩合单宁含量对总挥发性脂肪酸与各种酸的产量均有显著影响，缩合单宁含量高的植物其丙酸含量显著增高，TVFA和乙酸显著降低，也与本次试验结果相近。另外，绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸和各种酸摩尔比例随采食时间推移的动态变化，也符合瘤胃中养分降解及瘤胃微生物利用变化的规律［26］。

4 结论

葡萄渣单宁对绵羊干物质、有机物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙和磷的表观消化率没有产生显著影响，但显著提高绵羊氮表观消化率和存留率；显著降低绵羊瘤胃液总氮和蛋白氮浓度而显著提高尿素氮浓度，对绵羊瘤胃液氨氮浓度没有产生显著的影响；显著提高绵羊瘤胃液丙酸摩尔比而显著降低丁酸摩尔比和乙丙比，对绵羊瘤胃液pH、总挥发性脂肪酸浓度和乙酸及其他酸摩尔比没有产生显著的影响。

［1］ 张秀玲，祝义伟，孙佳平.酿酒后的葡萄渣的综合利用［J］.食品工业科技，2008，（7）：284－285.

［2］ 张燕，朱济义.中国葡萄酒行业现状、存在的问题及发展趋势［J］.酿酒科技，2009，（11）：128－131.

［3］ Patra A K，Saxena J.Exploitation of dietary tannins to improve rumen metabolism and ruminant nutrition［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91（1）：24－37.

［4］ 李仁辉，侯新宇，赵黎.葡萄皮籽综合利用分析［J］.新疆农垦科技，2002，（4）：38－39.

［5］ Baumgartner T，Kluth H，Epperlein K，etal.A note on digestibility and energy value for sheep of different grape pomace［J］.Small Ruminant Research，2007，（67）：302－306.

［6］ Barry T N，Blarney B J.Secondary Compounds of Forages［M］.New York：Academic Press，1987：91－97.

［7］ 郝正里，刘世民，孟宪政.反刍动物营养学［M］.兰州：甘肃民族出版社，2000：273－277.

［8］ 张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术（第三版）［M］.北京：中国农业出版社，2007.

［9］ 冯宗慈，高民.通过比色测定瘤胃液氨氮含量方法的改进［J］.畜牧与饲料科学，2010，31（6－7）：37.

［10］ Barry T N，Forss D A.The condensed tannin content of vegetative Lotpedunculatus，its regulation by fertilizer application and effect upon prote solubility［J］.Journal of the Science of Food Agriculrure，1983，34：1047－1056.

［11］ Khazaal K，Orskov E R.The tigation on its potential use withinvitrogas production technique：an nespolyvinylpyrrolid one for the assessment of phenolic related ant nutritive factors in browse［J］.Animal Feed Science and Technology，1994，47：305－320.

［12］ Cortés J E，Moreno B，Pabón M L，etal.Effects of purified condensed tannins extracted from Calliandra，Flemingia and Leucaena on ruminal and postruminal degradation of soybean meal as estimatedinvitro［J］.Animal Feed Science and Technology，2009，151：194－201.

［13］ 张晓庆，郝正里，李发弟，等.红豆草缩合单宁对绵羊瘤胃代谢及饲粮尼龙袋降解率的影响［J］.草业学报，2010，19（1）：166－172.

［14］ 张昌吉，郝正里，李发弟.以粗料为主的日粮中添加酵母培养物对绵羊瘤胃内环境的影响［J］.中国畜牧兽医，2006，33（8）：4－5.

［15］ McDonald P.Animal Nutrition（4th Edition）［M］.New York：Copublished in the U.S.with Wiley，1988.

［16］ Wang Y，Barbieri L R，Berg B P，etal.Effects of mixing Sainfoin with alfalfa on ensiling，ruminal fermentation and total tact digestion of silage［J］.Animal Feed Science and Technology，2007，135：296－314.

［17］ 王桂瑛，毛华明，文际坤.玉米的加工处理对瘤胃液氨浓度的影响［J］.饲料工业，2005，26（23）：51－52.

［18］ 褚柯，毛华明.植物单宁对山羊的影响［J］.中国畜牧兽医，2006，33（9）：25－28.

［19］ 屠焰，刁其玉，张蓉，等.杂交构树叶的饲用营养价值分析［J］.草业科学，2009，26（6）：136－139.

［20］ 刘婷，郑琛，李发弟，等.茴香秸秆和茴香秕壳对绵羊营养价值的评定［J］.草业学报，2012，21（5）：55－62.

［21］ 魏占虎，李冲，李发弟，等.酵母β－葡聚糖对早期断奶羔羊生产性能和采食行为的影响［J］.草业学报，2013，22（4）：212－219.

［22］ Murphy J J，Kennelly J J.Effect of protein concentrate and protein source on the degradability of dry matter and protein in situ［J］.Journal of Dairy Science，1987，70：1841－1849.

［23］ 韩正康，陈杰.反刍动物瘤胃的消化和代谢［M］.北京：科学出版社，1988.

［24］ 张洁，陈旭伟，徐爱秋，等.瘤胃微生物对饲料碳水化合物的消化代谢［J］.中国奶牛，2008，（2）：17－20.

［25］ Ngamsaeng A，Wanapat M，Khampa S.Evaluation of local tropical plants byinvitrorumen fermentation and their effects on fermentation end－products［J］.Pakistan Journal of Nutrition，2006，5（5）：414－418.

［26］ 赵赛春，郑琛，李发弟，等.棉桃壳和氨化棉桃壳对绵羊的营养价值评定［J］.草业学报，2013，22（5）：280－286.