骨形态发生蛋白9介导的成骨及其调控研究进展

谭富强，刘 渤

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)最初是在Urist研究脱钙的骨基质可诱导骨形成中被发现[1]，属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员之一,在骨骼发育、骨形成和干细胞分化中起着至关重要的作用。人类中被鉴定的BMP至少有15种，其中BMP2、4、6、7和9具有成骨能力，而BMP9是目前公认的BMP家族中成骨能力最强的蛋白。BMP9也被称为生长分化因子2(growth differentiation factor 2，GDF-2)，最初是胎鼠肝cDNA文库中分离而来，可在小鼠肝脏中高表达并刺激干细胞增殖[2]。目前研究发现，BMP9在调节糖脂代谢及造血细胞功能、诱导软骨细胞分化，调控血管生成及肿瘤发生等方面均具有重要作用。而在BMP9成骨研究领域，近年也取得了较多进展。

1 BMP9的结构特点

人的BMP9位于10 q11.22染色体，其前体蛋白包含428个氨基酸残基，与BMP2、4、5、6、7、8分子前体蛋白的氨基酸序列50%～55%相同，BMP9前体蛋白能维持成熟BMP9的功能及稳定性。BMP9具有蝴蝶样构型的半胱氨酸支架结构，包含1个α螺旋表位和2个从中心延伸出的β片层，BMP9与其他BMP表现出的受体结合差异性与其螺旋袢上的残基及结合界面上的氨基酸不同有关[3]。

2 BMP9的成骨作用

2.1BMP9诱导成骨 Kang等[4]通过重组腺病毒AdEasy系统介导的方法，成功构建了AdBMP2～AdBMP15等14种腺病毒，转染C2C12细胞后结果显示BMP2、6、7、9均能在体内诱导骨形成，其中BMP9诱导成骨效应最强； 直接肌肉注射AdBMPs诱导的原位成骨效应较AdBMPs转染成骨祖细胞诱导的成骨效应弱，提示基于成骨祖细胞或干细胞的基因治疗是促进骨再生更有效的方法。Sheyn等[5]首次利用超声微泡技术将成骨基因导入小鼠股四头肌内，通过荧光素酶的表达、微型CT及组织学分析，结果显示重组人BMP9直接的声孔效应可引起异位骨的形成； 利用一种新型的电穿透技术，Aslan等[6]将人骨髓间充质干细胞(hMSC)和BMP9进行核转染，4周后可观察到骨组织形成。可见，BMP9是一种强有力的骨形成诱导因子。

2.2BMP9与骨再生 近年研究发现，BMP9在促进脊柱融合和修复骨缺损中具有重要作用。Dumont等[7]经皮向16只裸鼠腰部棘突与椎板之间注射AdBMP9转染的hMSCs，8周后，CT扫描和组织学分析均证实在注射区域即腰椎棘突、椎板与关节突之间有大量的异位骨形成，脊柱融合获得成功。Kimelman-Bleich等[8]通过建立小鼠的骨不连模型，明胶海绵填充骨缺损处，10d后利用BMP9治疗，可在骨缺损处形成骨桥并修复骨不连。在研究BMP9诱导肌源性干细胞成骨分化过程中，Li等[9]建立小鼠桡骨12mm骨缺陷模型，相比于BMP2对照组，BMP9处理组在骨缺损区域表现出更快、更多的骨桥形成。由此可见，BMP9具有强大的促骨再生作用。

3 BMP9成骨信号及其调控

研究发现，BMP9诱导成骨作用不被公认的成骨抑制剂骨形态发生蛋白3(BMP3)及头蛋白(Noggin)所抑制，提示BMP9有特殊的成骨机制[4，10]。BMP9具有成骨功能的I型受体活化素受体样激酶1、2(ALK1、2)[11]和Ⅱ型受体骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPRⅡ)、激活素Ⅱ型受体(ActRⅡ)[12]已被成功鉴定。在其成骨调控机制研究方面，近年来取得了较多进展。

3.1BMP9成骨信号调控因子

3.1.1正向调控因子

3.1.1.1多毛/增强的分裂相关阻遏蛋白1(hairy/enhancer of split-related repressor protein 1，Hey1) Hey1是碱性螺旋-环-螺旋转录抑制剂家族成员之一，是Notch信号途径的关键靶点。Sharff等[13]研究证实Hey1是BMP9介导的MSCs成骨早期上调最显著的基因之一； 染色质免疫沉淀分析证明Hey1是BMP9诱导的Smad信号通路的直接靶点。增加Hey1表达可增强BMP9诱导成骨分化，而沉默Hey1基因则降低成骨分化能力， 提示Hey1在BMP9诱导的Smad蛋白成骨信号通路中起正调控作用。

3.1.1.2过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ) PPAR-γ是成脂和成骨关键的调节因子，可结合脂肪酸衍生物并诱导前体脂肪细胞向终末脂肪细胞分化。Kang等[14]发现过量表达PPAR-γ2可刺激BMP9促进MSCs成骨和成脂分化； 在敲除PPAR-γ2的MSCs中和在PPAR-γ2-/-的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast，MEF)中，BMP-9介导的成脂和成骨作用均减弱，提示PPAR-γ2是BMP9介导的成骨分化作用中的正调控因子。

3.1.1.3DNA结合抑制因子(inhibitor of DNA binding,Id) 与Hey1类似，Id对碱性螺旋-环-螺旋转录因子活性起负调节作用。目前研究表明，DNA结合抑制因子1、2、3(Id-1、2、3)基因在BMP9处理后早期阶段显著上调，3d后降至基础水平； 利用RNA干扰技术抗默该3种基因或过表达该3种基因，均显著减弱BMP9诱导的成骨分化[15]。由此可见，Id基因能在BMP9诱导MSCs成骨分化早期阶段发挥重要的促进作用。

3.1.1.4结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF) CTGF是即刻早期基因CCN家族成员之一，在骨形成、软骨细胞成熟和胚胎发育中起重要作用。与Id基因相似，CTGF在BMP9诱导的早期阶段表达，5d后降到基础水平； siRNA介导的CTGF基因沉默和CTGF组成性过表达均消弱BMP9介导的MSCs成骨分化； 外源性表达的CTGF可促进细胞迁移和MSCs的募集，由此推测，CTGF在BMP9介导的MSCs早期成骨分化中可调控成骨祖细胞的增殖和募集[16]。

3.1.1.5缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α) HIF1α是血管生成的重要调节因子，可同时激活血管生成信号和BMP9介导的MSCs成骨信号。BMP9可通过Smad1/5/8信号途径直接诱导MSCs中HIF1α表达； 外源性的HIF1α过表达能协同BMP9诱导MSCs成骨分化； 而沉默HIF1α基因显著抑制BMP9介导的成骨，提示HIF1对BMP9的成骨效应具有协同作用[17]。

3.1.1.6环氧酶2(cyclo-oxygen-ase 2,COX-2) COX-2是应激后迅速产生的诱导酶，催化前列腺素(PGs)合成，参与炎症反应。最近研究表明[18]，COX-2可在BMP9诱导MSCs成骨分化中作为直接靶点上调； 使用COX-2抑制剂NS-398和基因敲除COX-2均可有效减弱BMP9诱导的早、晚期成骨标志物表达及基质矿化； 敲除COX-2基因明显降低磷酸化Smad 1、5、8蛋白活性，抑制Smad6、Smad7及核心结合蛋白因子2(Runx2)、远端缺失同源盒5(DLX-5)的表达，从而抑制骨形成。COX-2通过与BMP9形成重要的调节环路在BMP9介导的Smad成骨信号中起着重要调控作用。

3.1.1.7表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF) EGF是一种可刺激表皮和其他多种细胞分裂的蛋白质。EGF增强BMP9诱导早期和晚期成骨标记物表达，但被EGF受体抑制剂吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)及酪氨酸激酶受体抑制剂AG-1478、 AG-494显著抑制；干细胞移植研究发现EGF可有效增强BMP9诱导的异位成骨； EGF发挥上述作用也是通过调控BMP9诱导的Smad信号通路实现的[19]。

3.1.1.8富含半胱氨酸的表皮生长因子样蛋白2(cysteine-rich with EGF-like domains protein 2，Creld2) Creld2是定位于内质网-高尔基体的内质网应激诱导因子。全基因组表达谱分析表明Creld2是BMP9刺激MSCs成骨分化中上调最明显的基因之一； Smad1/5/8以依赖BMP9的方式直接结合Creld2 增强子； 外源性表达Creld2增强BMP9诱导早期和晚期成骨标记物表达、基质矿化及异位成骨； 沉默Creld2基因则出现相反作用。Creld2 可能主要在BMP9介导成骨效应的终末期发挥正调控作用[20]。

3.1.2负向调控因子

3.1.2.1成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2) FGF2可在骨折愈合过程中大量分泌，提示其参与成骨过程。FGF2通过阻断BMP9诱导的Smad信号，降低依赖Smad的ALK1和ALK2的表达而抑制成骨，这种效应可被外源性表达ALK1和 ALK2所挽救，提示FGF2是BMP9诱导MSCs成骨信号中重要抑制因子[21]。

3.1.2.2组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs) HDACs催化组蛋白的去乙酰化，维系组蛋白乙酰化与去乙酰化的平衡状态。HDACs抑制剂制滴菌素(TSA)可增强BMP9诱导的早晚期成骨标志物表达和基质矿化，扩大软骨板生长，促进软骨内骨形成。基于HDACs在MSCs中形成负反馈信号微调BMP9成骨信号的事实[22]，可利用HDAC抑制剂作为骨折愈合的新型疗法。

3.2BMP9成骨信号的串扰途径

3.2.1经典Wnt信号通路 Wnt是成骨细胞分化和骨骼发育中起关键作用的分泌型蛋白家族。Wnts结合于卷曲蛋白Frizzled(FRZ)和LRP-5/6共受体从而激活不同的信号通路。Tang等[23]发现，WNT3a和BMP9能增强彼此在MSCs和MEF中诱导碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的能力； Wnt通路拮抗剂FRZB抑制BMP9诱导的ALP活性比分泌型蛋白DKK1的抑制作用更强； FRZB过表达或敲除β-catenin基因，明显抑制BMP9诱导的体内异位成骨和体外基质矿化。基因芯片技术显示，BMP9诱导MSCs募集β-catenin和Runx2到骨钙素的启动子部位，这可能是成骨信号Wnt与BMP9相互作用的关键连接点，二者之间的具体作用机制有待进一步研究阐明。

3.2.2TGF-β1信号通路 TGF-β1信号在骨骼形成、成骨细胞增殖及骨矿化中起重要作用，可增加骨的强度和柔韧性。低浓度的重组TGF-β1(rhTGF-β1)可增强BMP9诱导C3H10T1/2中ALP、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)和I型胶原(collagen type I alpha 2，COL1A2)的表达及基质矿化； 高浓度的rhTGF-β1降低OCN和OPN表达，而不降低COL1A2的表达，提示TGF-β1信号在BMP9诱导MSCs成骨分化中具有剂量相关的双相调节作用[24]。

3.2.3丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路 目前研究发现，BMP9可磷酸化并激活MAPK主要亚族P38、细胞外调节蛋白激酶2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)表达。P38抑制组抑制BMP9诱导的ALP活性和钙盐沉积，而ERK1/2抑制组表现出完全相反的作用[25]； JNK抑制剂SP600125和siRNA JNK均抑制BMP9成骨转录因子Rux2表达[26]。体内研究还发现[27]，抑制p38减少BMP9诱导成骨，形成薄骨小梁、更多软骨细胞和大量的间充质祖细胞，而RNAi介导的ERK1/2基因沉默则表现相反，进一步说明p38和ERK1/2可通过Smad信号轴在 BMP9诱导MSCs成骨分化中起相反的调节作用。

3.2.4Notch信号通路 Notch是一种跨膜蛋白，其信号在决定细胞分化和细胞命运中具有至关重要的作用。经AdBMP9处理后,Notch信号通路配体和受体均有不同程度的上调,其中受体Notch4和配体Jag-1上调最明显，提示Notch信号参与BMP9介导的成骨分化,其机制可能是BMP9诱导Notch信号中配体和受体上调，使Hey1表达升高而协同成骨[28]。

3.2.5生长激素(GH)/ JAK/STAT/IGF1途径 Huang等[29]发现GH是BMP9过表达时上调最明显的基因之一，基因芯片技术证实GH是BMP9/Smad途径直接靶点。外源性表达GH协同BMP9早、晚期成骨作用，而被JAK/ STAT通路抑制剂明显抑制，且IGF1的表达也被抑制，提示GH可作为BMP9信号的直接靶点，与BMP9协同激活JAK/STAT/IGF1信号通路，有效地促进骨形成。

3.2.6胰岛素生长因子2 (IGF-2)/PI3K/AKT信号轴 IGF-2是一种单链多肽分子，在胚胎形成和发育中起重要作用。外源性IGF-2表达可增强BMP9诱导的ALP、OPN和OCN活性，促进BMP9介导的骨成型蛋白受体-Smad表达及异位成骨； 而PI3K抑制剂LY294002则通过减弱IGF-2活性抑制BMP9成骨，说明BMP9信号通路可与PI3K/AKT信号中IGF-2耦联，共同调节MSCs成骨分化[30]。

3.2.7类维生素A(RAs)信号通路 在MSCs中，全反式维甲酸(ATRA)和9 顺式维甲酸(9cRA)显著诱导ALP、OPN和OCN表达并增加基质矿化，AdBMP9过表达可协同上述作用； 体内干细胞移植实验发现，类维生素A受体a与BMP9在诱导骨小梁和骨样基质产生中也具协同作用。由此推断，类维生素A信号能有效增强BMP9诱导成骨分化作用[31]。

3.2.8CXCL12/CXCR4信号轴 趋化因子CXCL12可以在许多组织中表达，对淋巴细胞有强烈的趋化作用，CXCR4是其受体。Liu等[32]最近发现，腺病毒介导的CXCL12/CXCR4预处理C3H10T1/2细胞后，通过激活MAPK-Smad信号通路明显增强早、中期成骨标志物ALP、骨钙素，转录因子Runx2、Osterix(OSX)、早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)和DLX5的表达，而不会影响后期的成骨细胞标记物及钙沉积的变化。CXCL12/CXCR4信号轴可能是BMP9诱导成骨分化的一个先决条件，在早、中期成骨分化过程中起协同作用。

4 结论及展望

BMP9作为目前BMPs家族中成骨能力最强的蛋白，动物实验证明它在修复骨缺损和促进脊柱融合方面具有良好的临床应用前景； 其不被BMP3及Noggin所抑制，提示BMP9有特殊的成骨机制。但BMP9成骨信号调控和串扰的具体分子机制及其临床应用的安全性等问题仍有待进一步深入研究。

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