中缅树鼩体重、血清瘦素和下丘脑神经肽表达量的季节性变化

朱万龙, 蔡金红, 张 麟, 王政昆

(云南师范大学 生命科学学院，昆明 650500)

自然环境中，环境因子的季节性变化对动物的繁殖、生存和能量代谢等生理生态特征有着重要的影响[1]。由于气候条件的变化，环境因素与生物相互作用，并共同影响着动物对能量的分配、获取、处理及消耗[2]。在季节性变化中，面临持续的环境变化时，生物有机体不断的调整自身的生理生态特征，从而维持体重稳态[3]。许多研究认为，季节变化影响着很多物种的体重和能量平衡[4, 5]。而有生物机体只有在能量的获得和消耗之间保持平衡的情况下，才能够维持正常的繁殖和生存，这种平衡依赖于能量摄入、消化过程以及能量分配之间的相互作用[6]。在寒冷的冬季，动物为了适应外界环境，维持自身体温的恒定，会使产热增加，从而增加能量消耗，最终使得能量摄入增加，所以，能量摄入的增加可能是由于动物对冬季寒冷环境产热增加的适应性变化，从而维持体重平衡[7]。

瘦素是由白色脂肪细胞分泌的蛋白类激素[8]，通过血液循环作用于下丘脑，与下丘脑中的受体结合，可抑制摄食，促进产热[9]。瘦素通过中枢神经系统的调控与机体能量稳态平衡紧密的联系在一起，可调节机体食物摄入和能量消耗[10]。在维持能量代谢活动中，下丘脑发挥着关键的作用，是能量平衡和代谢平衡的调控中枢[11]，下丘脑各个核团之间，各种神经肽相互形成了调控网络，这是能量平衡的基础[12]。下丘脑神经元会分泌一些神经肽，这些神经肽可分为两类：1)促进食欲神经肽：比如神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相关蛋白(agouti related peptide，AgRP)，可刺激进食和抑制能量消耗。2)抑制食欲神经肽：比如阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)、可卡因-安他非明转录调节肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide，CART)，可抑制食物摄入和刺激能量消耗[13]。其中NPY由36个氨基酸组成，是一种高度保守的多肽，是摄食最强的刺激因子，在1982年最早被分离出来[14]，广泛分布于外周神经系统和中枢神经系统，其生物学功能主要是参与调节动物的摄食行为、生物节律性、平滑肌的收缩、呼吸调节以及影响下丘脑神经内分泌活动[15]。POMC由267个氨基酸组成，是一种前体蛋白，是一类厌食的神经肽，在动物的应急、摄食和能量代谢等的调节中起着非常重要的作用[16]。CART是在动物体内广泛分布的一种神经肽类物质[17]，最初由Spiess等[18]在羊下丘脑的抽提物中分离出来，可抑制动物的摄食行为，降低体重，并受瘦素的调节[19]。动物下丘脑分泌的这些神经肽通过调节食欲强弱和机体能量代谢活动来维持能量的平衡，NPY、POMC和CART基因的表达平衡说明了下丘脑体重调节平衡的正常状态[20]。

中缅树鼩(Tupaiabelangeri)属攀鼩目(Scandentia)树鼩科(Tupaiidae)，主要分布于南亚、东南亚，中国广西南部、云南、四川西南、贵州西南部及海南岛，为东洋界特有的小型哺乳动物，在国内仅有中缅树鼩一种，以现生树鼩的分布特征来看，云贵高原及其附近的横断山地区可能构成了中缅树鼩的分布北限[21]。之前的研究表明，中缅树鼩的体重、产热和能量收支具有季节性变化[22]，消化道也具有季节性变化[23]，但是对于血清瘦素和下丘脑神经肽在能量代谢中的作用还没有报道。本研究基于以上的结果，对不同季节中缅树鼩的体重、体脂、血清瘦素和下丘脑神经肽表达量进行测定，为进一步研究下丘脑神经元在中缅树鼩中的体重调节和能量稳态调节奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集

中缅树鼩春(3月)夏(6月)秋(9月)冬(12月)季各8只(4♂，4♀)、9只(4♂，5♀)、8只(4♂，4♀)和8只(4♂，4♀)，动物捕回后适应3 d，之后处死动物，测定体重和体脂，制备血清，以测定其瘦素的含量，并取出下丘脑放于-80℃保存，用于RNA提取。激素于2012年11—12月在云南省昆明医学院第二附属医院进行测定；其它实验均在云南师范大学生命科学学院实验室进行。

1.2 体重和体脂测定

体重在动物处死后称量，体脂含量采用丹麦福斯公司生产的SoxtecTM2043浸提装置测定，将已去除内脏等消化道器官的动物胴体置于60℃烘箱中干燥至恒重，取出来后称量胴体总重，然后用小型粉碎机粉碎混匀后，称取2 g左右的样品测定脂肪含量。计算方法为：体脂含量(%)=总体脂重量(g)/胴体干重(g)×100%[3]。

1.3 血清瘦素含量测定

将动物处死后，取血，放于4 ℃静置1 h，于4 ℃、4000 r/min离心30 min，吸取上层血清置于-80 ℃超低温冰箱内保存。血清瘦素含量采用瘦素放射免疫分析试剂盒(美国Linco公司生产) 测定。批内差和批间差小于5 %。

1.4 下丘脑神经肽表达量测定

1.4.1 RNA提取及纯度鉴定

下丘脑总RNA的提取与纯化按照RNApure高纯总RNA快速抽提试剂盒(BioTeke Co.)提供方法进行。琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。RNA于-80℃保存。

1.4.2 cDNA第一链合成

cDNA第一链的合成以下丘脑总RNA为模板，oligo(dT)18为反转录引物，按照M-MLV Frist Strand Kit试剂盒(Invitrogen Co.)提供方法进行。按表1冰浴配制反应体系，反应完毕后，-20℃ 保存。

表1 cDNA第一链合成反应体系

1.4.3NPY、POMC和CART基因cDNA核心序列的扩增

根据表2所列引物，引物采用Tang[13]和Palou[24]报道的引物。以上述cDNA第一链为模板进行RT-PCR，扩增条件均为：95℃变性5 min，95 ℃ 30 s，54～56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共37个循环，72 ℃ 延伸10 min。扩增体系为25 μL：其中含有1 μL Template(10 ng/μL)， 2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL MgCl2(25 mmol/ L)，2 μL dNTP Mixture(10 mmol/L，pH值8.0)，1 μL Primer 01 (10 pmol/μL)， 1 μL Primer 02(10 pmol/μL)，0.5 μLTaqenzyme(4 U/μL，购自北京博迈德生物公司)，16 μL ddH2O。RT-PCR产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并送至昆明硕阳科技有限公司进行正反两个方向的序列测定。

表2 扩增中缅树鼩NPY、POMC、CART序列所用引物

1.4.4 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)

采用ABI-7000TM实时荧光PCR仪扩增模板cDNA，并检测荧光信号。按SYBR Green realmastermix Mix试剂盒说明配制FQ-PCR 反应体系如下(表3)。

表3 FQ-PCR反应体系

每个样本基因进行3次FQ-PCR平行重复，后续数据处理均采用3个平行结果的平均值。内参基因引物为：F：GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC；R：CATCTGCTGGAAGGTGGACA。扩增条件为94℃2 min；94℃15 s，60℃35 s，重复40个循环。

1.4.5 2-△△CT相对定量法

采用2-△△CT公式法定量计算目的基因的转录表达水平，用内参基因作均一化处理，ΔΔCT=(CT目的基因-CT内参基因)处理组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组，目的基因的表达水平2-△△CT可反映出该样本目的基因的初始模板量用内参基因均一化处理后相对于对照样本的表达倍数 (差异)[13]，对于对照样本，ΔΔCT=0，2-△△CT=1，对于处理组样本来说，如果2-△△CT>1，说明该基因表达上调，如果2-△△CT<1，则说明该基因表达下调。

1.5 数据处理

利用SPSS16.0统计软件包进行相关统计处理，体重用单因素方差(One-way ANOVA)分析，体脂、血清以及下丘脑神经肽表达量结果采用协方差(ANCOVA)分析，体重作为协变量，组间差异性用多组比较(Duncan)分析。雌雄中缅树鼩的各指标差异均不显著(P>0.05)，故两者也可合并统计。均以平均值±标准误表示(Mean±S.E.)，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 体重和体脂的季节性变化

不同季节间，中缅树鼩体重差异极显著(F=20.984，P<0.01)(图1)；体脂差异极显著(F=8.172，P<0.01)(图2)，其中体重和体脂都是冬季最高，夏季最低。

图1 中缅树鼩体重的季节性变化

注：不同字母代表差异性显著,下同。

图2 中缅树鼩体脂的季节性变化

2.2 血清瘦素浓度和下丘脑神经肽表达量的季节性变化

中缅树鼩不同季节的血清瘦素浓度分别为7.14 ng/mL±0.44 ng/mL、7.94 ng/mL±0.31 ng/mL、6.91 ng/mL±0.57 ng/mL、6.19 ng/mL±0.71 ng/mL，其中夏季显著高于冬季(P<0.05)，而春秋季与夏冬季差异不显著(图3)。中缅树鼩的体重和血清瘦素具有显著的负相关(r=-0.540,P<0.01; 图4)。

图3 中缅树鼩血清瘦素浓度的季节性变化

图4 中缅树鼩体重和血清瘦素浓度的关系图

图5 中缅树鼩下丘脑NPY表达量的季节性变化

NPY：不同季节间，中缅树鼩下丘脑神经肽NPYmRNA表达量差异不显著(F=2.147，P>0.05)(图 5)。POMC: 不同季节间，中缅树鼩下丘脑神经肽POMCmRNA表达量差异显著(F=7.433，P<0.05)，其中夏季显著高于其他季节，冬季最低(图 6)。CART: 不同季节间，中缅树鼩下丘脑神经肽CARTmRNA表达量差异不显著(F=2.856，P>0.05)(图 7)。

图 6 中缅树鼩下丘脑POMC表达量的季节性变化

图7 中缅树鼩下丘脑CART表达量的季节性变化

3 讨论

面对外界环境的不断变化，动物会出现生理生态特征的表型可塑性，从而使能量摄入与能量消耗之间存在一个动态平衡[1]。能量摄入与体重、消化等因素有关。如果要测定动物的营养状态，体重则是一个重要因子，这也取决于能量摄入和能量消耗之间的平衡。许多小型哺乳动物在缺乏食物和冷胁迫的环境中，通过减少总能量需求来降低体重，从而适应环境[1]，如长爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[3]、布氏田鼠等(Microusbrandti)[5]。而中缅树鼩的体重变化特征与它们不同，随着环境温度的降低，体重不断的增加，这与金黄仓鼠(Mesocricetusauratus)和潘帕斯鼠(Akodonazarze)等情况相似[25]。这很可能与中缅树鼩的分布区有关，中缅树鼩分布于热带亚热带及其高原地区，在冬季没有冰雪覆盖，食物资源相对比较充足。因此，可增加摄食量来满足能量消耗的增加，从而导致体重增加。在寒冷环境中，小型哺乳动物会增加体内的脂肪存储来弥补能量的消耗[26]。研究表明长爪沙鼠在低温条件下会增加体内脂肪存储，作为能量来源的补充[27]。中缅树鼩体脂的变化与体重的变化相一致，均为冬季最高，夏季最低。这与中缅树鼩的生活环境是密不可分的，禄劝地区属滇中高原北部，北亚热带高原气候，年平均温度为15.6℃，冬季没有冰雪覆盖，食物资源充足，摄入量的增加使体重增加，从而导致体脂增加。

中缅树鼩的血清瘦素浓度冬季最低，低浓度的瘦素可防止进一步消耗能量，从而维持能量的平衡。在寒冷的冬季，低温诱导中缅树鼩降低瘦素含量，形成饥饿信号，从而增加能量摄入，以补偿寒冷环境下维持生存所需的能量。瘦素作为一种信号，通过血液循环作用于下丘脑[28]，低浓度瘦素可促进NPY的分泌[29]，从而食欲增强，摄入量增加，以满足产热的需要。此外，中缅树鼩的体重和血清瘦素呈负相关，与冷驯化条件下体重和血清瘦素的相关关系相似，说明在冬季或者低温条件下，低浓度的瘦素有利于增加能量摄入，从而增加体重[30]。下丘脑神经元NPY、POMC和CART被认为在能量调节中有重要的作用[12]。下丘脑存在的NPY通路能增加食欲和摄食量，这与NPY神经元广泛分布的侧支刺激食欲的反应有关。中缅树鼩下丘脑神经元NPY的表达量在夏季最低，冬季最高，春季和秋季变化不大，与体重和摄入量的变化趋势一致。NPY基因表达量增加，则促进食欲的增加，从而导致摄入量增加，摄入量的增加最终使体重增加，以补偿中缅树鼩在冬季产热增加。而POMC和CART有抑制食欲的作用，在夏季，POMC和CART基因的表达量相对增加，抑制了食欲，导致摄入量降低，以适应夏季炎热的环境。

综上所述，中缅树鼩通过增加体重和体脂来适应冬季的寒冷环境，并表现出了季节性变化。在此过程中，瘦素作为信号，作用于下丘脑，通过控制神经肽NPY、POMC、CART基因的表达量来调节中缅树鼩能量稳态。

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