抗菌肽促进创伤愈合研究进展

蒋 艳 综述，王仙园 审校

（第三军医大学护理学院：1.基础护理学教研室；2.野战护理学教研室，重庆400038）

抗菌肽（antibacterial peptide），由10～50个氨基酸组成，存在于上皮和免疫组织中，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性，人类抗菌肽构成了机体先天性免疫系统的第一道防线，被广泛研究[1]。目前越来越多的研究表明，抗菌肽的作用远不止于此，它广泛参与维持机体完整性的一系列相关生物学活动，包括创伤修复[2]。国内相关报道较少，现将其中3种抗菌肽与创伤修复研究进展综述如下。

1 LL-37

人体内发现的惟一的cathelicidins抗菌肽家族成员，含37个氨基酸，主要表达于某些骨髓源性细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等）、角质形成细胞、组织上皮细胞及某些腺体等易与微生物发生接触的部位，能被感染或创伤诱导产生。研究已证实LL-37对革兰阴性和阳性菌有广谱抗菌作用[3]。而Dorschner等[4]在皮肤无菌手术创缘检测到LL-37高表达，推测可能与创伤愈合相关。创伤愈合是一个被多种生长因子和特异性胞内信号通路调节的有序过程，涉及炎症、细胞增殖、迁移及血管再生等多个环节，目前研究逐步发现LL-37能够通过多种途径参与伤后上皮重建。

Heiborn等[5]发现，皮肤受急性创伤后，LL-37表达增强，48h达到高峰，创面愈合后表达恢复正常；而慢性难愈性溃疡创面虽LL-37mRNA高表达，但其蛋白水平低下，推测与其基因转录过程障碍有关，由此提出LL-37水平与创伤正常愈合相关。进一步的研究发现，LL-37抗体能推迟组织工程皮肤创伤修复，且表皮细胞表面增殖免疫标记物Ki67缺失，提示LL-37可能是通过影响表皮细胞增殖功能，进而促进创伤修复。而Carretero等[6]的研究发现，LL-37可以通过诱导皮肤表皮Hacat细胞株迁移表型改变，活化黏附相关激酶，加速该细胞迁移；而对手术后大鼠外源性局部补充LL-37，肉芽组织形成和上皮再生速度加快。除对细胞增殖和迁移功能的影响外，LL-37能够促进血管内皮细胞增殖而诱导新生血管形成。Koczulla等[7]发现，缺乏LL-37基因表达的大鼠创伤后新生血管减少，推测LL-37介导的血管再生是体内皮肤创伤新生血管形成的重要环节，再次强调了LL-37在创伤修复中的应用潜力。

除皮肤组织外，LL-37对其他部位的创伤愈合同样能起到促进作用。Shyakhiev等[8]发现，LL-37在体外能促进气管上皮细胞以及气管标准细胞株NCI-H292增殖和迁移，参与气道创面修复。另有研究者将LL-37用于高糖环境下组织工程角膜组织，发现角膜 HCECs细胞株划痕创伤愈合加快[9]。Wu等[10]的研究发现，鼠cathelicidin家族成员rCRAMP与胃组织创伤修复有关，胃溃疡创面rCRAMP表达上调，rCRAMP基因治疗通过刺激血管再生、细胞增殖加速溃疡面愈合。

目前多数研究认为，LL-37促进创伤愈合由受体介导。LL-37作用皮肤表皮细胞后10min即能检测出表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化，使用STAT3通路显性失活突变体转染角质细胞可以抑制LL-37诱导的迁移功能，提示LL-37的促迁移活性主要与EGFR以及下游STAT3通路有关[11]。进一步研究发现，LL-37作用下，Hacat细胞基质金属蛋白酶和胞外信号调节激酶，EGFR或G蛋白偶联受体共同活化，促进细胞迁移[6]。LL-37对气道表皮细胞作用的机制与之类似，由EGFR、G蛋白偶联受体、MAP／胞外调控通路介导[8]。而LL-37活化高糖环境下角膜细胞功能的机制研究显示，LL-7能部分恢复高糖抑制的EGFR途经，延长该通路对创伤的反应，提示LL-37可能是EGFR通路的增强剂[9]。而鼠rCRAMP促进胃黏膜上皮细胞增殖主要通过EGFR反式激活及下游的ERK1／2通路介导。由此，许多研究者提出LL-37可能是表皮细胞的又一类生长因子[10]。但具体的LL-37作用通路仍需深入研究。

2 富组蛋白家族（histatins，Hsts）

Hsts是涎腺特异性产物，仅存在于人类和其他灵长类动物唾液中，由12个成员组成，以 Hst1、Hst3、Hst5为主要成员，占总量的95%，三者含量比为1∶3∶1，其中，Hst1、Hst3、Hst5是主要的研究对象[12]。目前，研究认为Hsts对以口腔黏膜细胞为代表的多种细胞具有促增殖或迁移功能。

Oudhoff等[13]利用体外创伤愈合模型研究唾液成分与口腔黏膜创伤愈合的相关性，认为富组蛋白家族是促进口腔黏膜创伤快速愈合的主要影响因子，且在生理浓度5～100μg／mL范围内均具有活化细胞能力。此后，研究者考察了Hsts对原代口腔黏膜上皮细胞、口腔成纤维细胞功能的影响，结果一致，据此推测富组蛋白具有维持口腔黏膜组织结构完整性的功能[14]。研究同时发现，仅腮腺唾液能显著促进创伤愈合外，而其他涎腺唾液几乎无此功能，可能与其他涎腺分泌黏蛋白抑制细胞迁移和黏附有关，但黏蛋白与Hsts之间的相关性尚不明了[15]。Hsts促口腔黏膜创伤愈合的机制也不清楚，仅认为其促愈机制与其抗真菌机制不同，也不同于其他抗菌肽促愈合机制。现有的相关性结论是Hsts作用不依赖于EGFR，与上皮细胞作用可能是通过与G蛋白偶联受体结合后内吞，产生一系列效应。初步发现Hst2促创伤愈合的活性能被ERK1／2通路抑制剂削弱，但该蛋白影响细胞功能具体的胞内信号途径以及活化过程有待进一步研究。另外Hst2作用具有结构立体特异性，D-Hst2无促进口腔黏膜细胞迁移功能[13]。

尽管富组蛋白仅在唾液内表达，至今未在其他体液内发现，但有研究提示该蛋白对某些非口腔细胞同样具有活化功能。Murakami等[16]研究发现，Hst5呈剂量依赖性促进兔肋软骨细胞DNA合成，并发现Hst5与EGF具有显著协同作用，联合使用能显著提高该细胞DNA合成率近40倍，认为Hst5可能是EGF的生理调节剂。Oudhoff等[14]研究也发现，Hst2能促进人成纤维细胞迁移，而促增殖作用较弱，参与创伤愈合早期，且无细胞毒性和促炎性反应功能。这为合成富组蛋白用于皮肤创伤修复治疗提供了实验室基础。此外，Hst2还可以促进乳腺癌来源的表皮细胞株MCF7体外创面愈合。综上推测富组蛋白受体不仅仅存在于口腔来源细胞。笔者在体外利用人工合成Hst1作用与人表皮细胞Hacat细胞株及成纤维细胞株体外划痕创伤，发现人工划痕修复速度加快[17]。

由于口腔黏膜创伤较皮肤创伤具有愈合速度快，愈后无瘢痕的优势，因此，Hsts对包括皮肤组织在内的创伤修复作用究竟如何，作用机制是什么值得进一步研究。

3 人防御素（defensins）

防御素，含12～50个氨基的阳离子蛋白，在人类该家族包括α-及β-两组成员。α-1、2、3、4由中性粒细胞产生，α-5、6由肠组织腺体分泌，β-防御素主要由包括皮肤和呼吸道在内的上皮组织产生[18]。

研究显示，烧伤、急性或慢性创伤后，在IL-7、TNF-α和IL-1等细胞因子或生长因子作用下，或细菌（如金黄色葡萄球菌）刺激，防御素表达增加，相关的信号通路包括TLR／NF-κB，p38MAPK和JAK／STAT；而增加的防御素继而活化MARK、Akt、STAT1、STAT3通路，并活化细胞内 Ca2＋，EGFR磷酸化，刺激创伤修复细胞，促进成纤维细胞和角质形成细胞增殖和迁移，从而加快皮肤创面愈合。另有研究者发现，人工合成的防御素能促进皮肤成纤维细胞前胶原蛋白和mRNA的表达，同时下调基质金属蛋白酶-1表达，以促进细胞外基质沉积而加快伤口愈合，提示防御素具有促进生物合成和组织重塑反应的作用[19]。β-防御素在刺激血管生成方面的作用与与VEGF相似，但在VEGF抗体作用下时仍能够刺激血管网络形成，提示防御素促进血管的形成机制不同于VEGF。

此外，防御素对气道、角膜、肠道损伤的修复同样能起到加速作用[20-22]。研究发现低浓度的（≤10μg／mL）的防御素即能通过活化气道上皮细胞标准株EFFR和ERK1／2通路，促进该细胞的迁移及增殖，而加速气道上皮创伤愈合；同时，可诱导糖蛋白MUC5B、MUC5AC的表达，与气道上皮细胞分化有关。防御素对肠道上皮创伤的愈合作用以促进上皮细胞迁移为主，对其增殖作用较弱，同时可促进其表达黏蛋白2、3，改善凋亡。而角膜或结膜创伤后，泪液中的防御素表达水平增加，提示其可能参与创伤修复过程。

目前，临床发现耐药菌株大量出现是影响创面感染控制的一大障碍，因此，一方面这些宿主抗菌肽在抵抗病原微生物上表现出极大的应用前景，另一方面抗菌肽可能是一种影响创伤愈合的直接细胞信号分子，对皮肤再生具有潜在的治疗性作用，有一定的研究价值[23-24]。当前面临的挑战是：抗菌肽促进创伤愈合的机制，胞内信号途径究竟如何；如何建立有效的动物模型，虽然许多抗菌肽在体外是具有活性的，但体内模型中超过生理浓度的抗菌肽（除富组蛋白外）对宿主往往是具有毒性的，局部用药治疗能否帮助克服这种临床障碍；如何设计抗菌肽治疗药物，在保留促创伤修复能力的同时降低其细胞毒性[25]。

[1] De Smet K，Contreras R.Human antimicrobial peptides：defensins，cathelicidins and histatins[J].Biotechnol Lett，2005，27（8）：1337-1347.

[2] Radek KA，Gallo RL.Amplifying haling：the role of anti-microbial peptides in wound repair[J].Adv Wound Care，2010（1）：223-229.

[3] Durr UH，Sudheendra US，Ramamoorthy A.LL-37，the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides[J].Biochim Biophys Acta，2006，1758（9）：1408-1425.

[4] Dorschner RA，Pestonjamasp VK，Tamakuwala S，et al.Cutaneous injury induces the release of cathelicidin antimicrobial peptides active against group A Streptococcus[J].J Incest Dermatol，2011，117（1）：91-97.

[5] Heilborn JD，Nilsson MF，Kratz G，et al.The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium[J].J Invest Dermatol，2003，120（3）：379-389.

[6] Carretero M，Escámez MJ，García M，et al.In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37[J].J Invest Dermatol，2008，128（1）：223-236.

[7] Koczulla R，von Degenfeld G，Kupatt C，et al.An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37／Hcap-18[J].J Clin Invest，2003，111（11）：1665-1672.

[8] Shaykhiev R，Beiäwenger C，Ka¨ndler K，et al.Human endogenous antibiotic LL-37stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，289（5）：L842-L848.

[9] Yin J，Yu FS.LL-37via EGFR transactivation to promote high glucose-attenuated epithelial wound healing in organcultured corneas[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51（4）：1891-1897.

[10] Wu WK，Wong CC，LI ZJ，et al.Cathelicidins in inflammation and tissue repair：potential therapeutic applications for gastrointestinal disorders[J].Acta Pharmacologica Sinica，2010，31（9）：1118-1122.

[11] Tokumaru S，Sayama K，Shirakata Y，et al.Induction of keratinocyte migration via receptor by the antimicrobial peptide LL-37transactivation of the epidermal growth factor[J].J Immunol，2005，175（7）：4662-4668.

[12] Campese M，Sun X，Bosch JA，et al.Concentration and fate of histatins and acidic proline-rich proteins in the oral environment[J].Arch Oral Biol，2009，54（4）：345-353.

[13] Oudhoff MJ，Bolscher JG，Nazmi K，et al.Histatins are the major wound-closure stimulating factors in human saliva as identified in a cell culture assay[J].FASEB J，2008，22（11）：3805-3812.

[14] Oudhoff MJ，van den Keijbus PA，Kroeze KL，et al.Histatins enhance wound closure with oral and non-oral cells[J].J Dent Res，2009，88（9）：846-850.

[15] Sun X，Salih E，Oppenheim FG，et al.Kinetics of histatin proteolysis in whole saliva and the effect on bioactive domains with metal-binding，antifungal，and wound-healing properties[J].FASEB J，2009，23（8）：2691-2701.

[16] Murakami Y，Nagata H，Shizukuishi S，et al.Histatin as a synergistic stimulator with epidermal growth factor of rabbit chondrocyte proliferation[J].Biochem Biophys Res Commun，1994，198（1）：274-280.

[17] 蒋艳，王仙园，罗向东.富组蛋白1促进皮肤创伤愈合的细胞学研究[J].解放军护理杂志，2012，29（3B）：24-26.

[18] 杨荣，嵇武.防御素的生物学活性及与疾病的关系[J].肠外与肠内营养，2011，18（3）：185-188.

[19] Hoq MI，Niyonsaba F，Ushio H，et al.Human catestatin enhances migration and proliferation of normal human epidermal keratinocytes[J].J Dermatol Sci，2011，64（2）：108-118.

[20] Aarbiou J，Verhoosel RM，Van Wetering S，et al.Neutrophil defensins enhance lung epithelial wound closure and mucin gene expression in vitro[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2004，30（2）：193-201.

[21] Zhou L，Beuerman RW，Huang L，et al.Proteomic analysis of rabbit tear fluid：Defensin levels after an experimen-tal corneal wound are correlated to wound closure[J].Proteomics，2007，7（17）：3194-3206.

[22] Otte JM，Werner I，Brand S，et al.Human beta defensin 2 promotes intestinal wound healing in vitro[J].J Cell Biochem，2008，104（6）：2286-2297.

[23] 王兴顺，耿艺介，李文楚，等.抗菌肽抗菌机制及其应用研究进展[J].微生物学免疫学进展，2012，40（4）：70-76.

[24] Seo MD，Won HS，Kim JH，et al.Antimicrobial peptides for therapeutic applications：a review[J].Molecules，2012，17（10）：12276-12286.

[25] Guo S，Dipietro LA.Factors affecting wound healing[J].J Dent Res，2010，89（3）：219-229.