结核感染T细胞酶联免疫斑点试验与结核抗体检测在骨关节结核辅助诊断中的价值

范俊 秦世炳 贾红彦 潘丽萍 兰汀隆

骨关节结核是肺外结核中最常见的慢性疾病[1]，常常隐匿起病，早期临床症状多不典型，早期诊断与鉴别诊断困难，易被延误治疗。而骨关节结核的早期诊断至关重要，及时的早期治疗可以减少躯体残疾和损伤的发生率[2]。目前，骨关节结核实验室诊断主要依靠结核分枝杆菌培养，但阳性率较低且耗时长，组织病理学诊断标本不易获得而且为有创性，从而使得骨关节结核的早期诊断面临巨大的挑战，因此迫切需要寻找一种新的辅助诊断方法以提高骨关节结核的早期快速诊断水平。结核抗体的检测已被广泛应用于血清及体液标本的检测，但敏感度和特异度并不理想[3]。近年来，酶联免疫斑点(ELISPOT)技术逐渐兴起，结核感染T细胞酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)即为其代表[4]。本研究初步探讨T-SPOT.TB和结核抗体检测在早期骨关节结核中辅助诊断的意义与价值。

资料和方法

一、 一般资料

选取2011年7月至2013年10月期间，在北京胸科医院收治的骨关节疾病患者432例，其中男250例，女182例；年龄15～77岁，平均(48±16.7)岁。排除其中诊断不明确的患者39例、无病理学或细菌学证据的患者40例和未完成全部检测的患者128例，共纳入225例患者。所有患者HIV检测均为阴性，均无免疫抑制剂及免疫增强剂使用史。将入选的225例患者分为结核组和对照组，均经T-SPOT.TB试验检测及血清学结核分枝杆菌特异性IgG抗体检测。本研究经首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会审核并通过[批件号：(2011)年KY临审第(13)号]，征得受试对象同意并签署知情同意书。

1.结核组入选标准：选择初治的骨关节结核患者，所有患者抗结核治疗均<1周，均行手术治疗，术后留取脓液送抗酸染色涂片镜检及结核分枝杆菌培养阳性，并由组织病理学确认结核病诊断。排除标准：术后结核分枝杆菌培养及组织病理不能确认诊断者；合并其他部位结核患者。符合入选标准的患者146例，排除标准排除54例，排除原因为合并肺结核、淋巴结结核等其他部位结核。最终入组92例，其中男53例，女39例，年龄15～76岁，平均(40.0±15.4)岁。以病理诊断或改良罗氏培养为金标准[5]，其中脊柱结核65例，髋关节结核8例，膝关节结核6例，肘关节结核5例，肩关节结核5例，腕关节结核2例，胸锁关节结核1例。

2.对照组入选标准：所有患者均行手术治疗，并由病理明确诊断。结核分枝杆菌培养及组织病理学均排除结核诊断，无其他部位结核和结核病接触史。排除标准：术后病理诊断不清楚及不能完成随诊。非结核骨关节疾病患者79例，按排除标准排除15例，排除原因为不能完成随诊。最终入组共64例，其中男35例，女29例，年龄16～77岁，平均年龄(43.3±17.8)岁。对照组患者包括脊柱肿瘤35例，强直性脊柱炎5例，化脓性关节炎6例，腰椎退行性病变12例，骨折患者6例。

两组患者的年龄经配对t检验(t=-1.117，P=0.266)，性别经卡方检验(χ2=0.131，P=0.717)，差异均无统计学意义。

二、 方法

1. T-SPOT.TB试验操作方法：采用 T-SPOT.TB检测试剂盒(英国Oxford Immunotech公司提供)并严格按照试剂盒说明书要求进行检测。骨关节结核患者均于住院次日凌晨空腹抽静脉血5 ml，肝素抗凝，用标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心方法分离得到外周血单个核细胞(PBMCs)，以自动细胞计数仪计数并调制成浓度为2.0×106/ml的细胞悬液。以细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素(PHA)作为阳性对照，结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)和培养滤液蛋白-10(CFP-10)作为刺激抗原。4个孔内分别加入含250 000 个PBMCs细胞的细胞悬液，将微孔板放在含有5%CO2的培养箱中培养18～20 h。洗板后加入生物素标记的二抗，2 ℃～8 ℃反应1 h，洗板后加入显色底物液，室温静置7 min后终止反应。观察结果，通过酶联免疫斑点系统(CTL-ImmunoSpot®S5 Versa Analyzer)记录斑点数。结果判定标准：当空白对照孔内斑点数<6个时，任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数≥6个，结果即为阳性；若空白对照孔斑点数≥6个，任一实验孔斑点数≥2倍空白孔斑点数，结果为阳性；若空白对照孔内斑点数≥10个或阳性对照孔内斑点数<20个，试验无效。

2.结核抗体检测：所有患者均行血清学结核分枝杆菌特异性IgG抗体检测。结核分枝杆菌抗体免疫印迹法试剂盒由北京宜安泰医疗技术开发有限公司提供，按试剂盒说明书进行检测及结果判定。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0进行统计学分析。预测值和似然比按下列公式计算：阳性预测值=真阳性例数/总阳性例数，阴性预测值=真阴性例数/总阴性例数，阳性似然比=真阳性率/假阳性率，阴性似然比=假阴性率/真阴性率。T-SPOT.TB试验检测数据与结核抗体检测数据之间的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

骨关节结核患者，以组织病理学及罗氏培养阳性至少其中一项为金标准，T-SPOT.TB方法敏感度和特异度分别为93.5%(86/92)和78.1%(50/64)；结核抗体检测的敏感度和特异度分别为64.1%(59/92)和81.3%(52/64)。T-SPOT.TB方法在92例骨关节结核患者中86例阳性，结核抗体检测59例阳性，92例骨关节结核患者两者的重叠率为60.9%(56/92)，抗结核抗体检测阳性而T-SPOT.TB检测阴性者2例；T-SPOT.TB检测阳性而抗结核抗体检测阴性者27例；两者均阴性2例。两组方法的比较采用χ2检验，两种检测方法特异度相近，但T-SPOT.TB方法阳性检出率高于抗结核抗体检测方法，差异有统计学意义(χ2=23.72，P<0.01)(表1)。

表1 T-SPOT.TB试验与结核抗体检测对骨关节结核病的诊断价值

讨 论

1.抗结核抗体对诊断骨关节结核的现状：对于骨关节结核的诊断，尤其早期骨关节滑膜结核的诊断，由于难于取材供细菌学和组织学检查，血清及各种体液特异度抗体的检查就变得非常需要。本实验中检测血清标本中结核抗体IgG的原理是通过对包括结核分枝杆菌在内的13种分枝杆菌菌体多肽抗原成分及结核病患者血清中结核分枝杆菌特异性抗体谱的分析,纯化出结核分枝杆菌H37Rv株菌体特异性多肽抗原成分，相对分子质量介于34 000～43 000 的蛋白质抗原)，从而检测血清标本中结核分枝杆菌抗原的抗体[6]。本研究中进行结核抗体检测的92例骨关节结核患者中，59例阳性，敏感度仅为64.1%，这可能与不同个体的免疫状态有关；或患者正处于临床感染的窗口期，可表现为抗体检测阴性。本检测的特异度81.3%，考虑原因如下：决定结核分枝杆菌抗体检测特异度的关键在于抗原的选择，目前重要的结核分枝杆菌感染血清检测抗原大多同时存在于非结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)中，本实验中结核分枝杆菌抗体检测试剂是经过Mtb与BCG蛋白组学电泳对比纯化出的BCG缺失蛋白成分，应具有较好的特异性，但是电泳分离不可避免微量BCG共有蛋白的污染[7]，造成假阳性的增高。

2.T-SPOT.TB检测技术在骨关节结核诊断中应用：近来，T-SPOT.TB检测技术利用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术的基本原理在单细胞水平检测分泌γ干扰素(INF-γ)的T淋巴细胞，已经成为一种新的结核分枝杆菌感染的快速诊断工具。通过结核分枝杆菌RD1区基因编码产生的ESAT-6和CFP-10来刺激机体T淋巴细胞，产生特异细胞因子γ干扰素来诊断是否存在结核分枝杆菌感染[8]。这2种蛋白为结核分枝杆菌特异性抗原，其编码基因在BCG和绝大多数非结核分枝杆菌的基因编码区是不存在的，因而从根本上避免了传统结核菌素皮肤试验中所存在的BCG交叉抗原反应，从而确保T-SPOT.TB具有较高的特异度。同时T-SPOT.TB检测技术自身的敏感度也较高，每100万个外周血单个核细胞中即可检测到一个特异性T淋巴细胞，对于肺外结核的诊断，T-SPOT.TB具有较高的敏感度。本研究应用T-SPOT.TB方法检测的92例骨关节结核患者中，86例T-SPOT.TB检测结果阳性，其敏感度为93.5%，此结果与Kim等[9]的研究结果一致。T-SPOT.TB的敏感度显著高于结核抗体检测技术(P<0.05)，因此T-SPOT.TB方法在骨关节结核的早期诊断中具有更重要的辅助诊断价值。

3.T-SPOT.TB检测技术的局限：本研究中，在64例非结核性骨关节疾病患者中，12例(18.8%)T-SPOT.TB结果阳性，导致本研究的特异度偏低。这主要是由于中国属于结核病高发病区，2010年统计的活动性肺结核患病率为459/10万[10]，发病率位居世界第二，结核潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者占总人口的44.5%[11]。T-SPOT.TB检测技术不能区分LTBI和活动性结核病[12-13]，其特异度受该地区LTBI流行情况影响，即使没有明确的结核病暴露史也有可能已存在LTBI，LTBI的高流行背景可能导致了T-SPOT.TB试验的低特异度。所以不能仅凭借T-SPOT.TB 试验阳性结果就诊断活动性结核病，仍需结合患者的临床病史、放射学诊断以及其他诊断方法做出综合的判断。

综上所述，在临床上疑似骨关节结核患者，在缺乏病原学依据的时侯，T-SPOT.TB试验作为一种非侵入性且便利的辅助诊断方法，其阳性结果能给临床医生提供更多诊断骨关节结核的有用信息。为了更为准确判断T-SPOT.TB试验在我国这种结核病高流行国家的骨关节结核病的辅助诊断价值，在以后的研究中还需要扩大样本量，并进行前瞻性研究，尤其是其特异度可能受LTBI的影响，有待进一步研究。

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