土壤中微生物DNA高效提取方法的筛选

2014-03-22 19:11周伟黄进勇李新伟

湖北农业科学 2014年1期

周伟+黄进勇+李新伟

摘要：设计了3种从土壤中直接提取微生物DNA的方法，并通过PCR扩增和DGGE电泳比较了不同方法所提取DNA的质量以及对后期分子生物学研究的适用性。结果表明，化学法和酶法相结合的提取方法所获得的DNA完整性最好，适用于PCR扩增，并且通过DGGE电泳分离出最丰富的条带，是一种高效的提取土壤微生物DNA的方法。

关键词：土壤微生物；DNA提取；PCR；DGGE

中图分类号：Q939.96；Q523 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0216-04

Screening the Extracting Method of Total Microbial DNA from Soil

ZHOU Wei1，HUANG Jin-yong2，LI Xin-wei1

（1. Luohe Medical College of Higher Education， Luohe 462002， Henan， China；

2. Bioengineering Department， Zhengzhou University， Zhenzhou 450001， China）

Abstract： Three methods were designed to extract microbial DNA directly from the soil， and the different extraction methods were evaluated comprehensively for the DNA quality and applicability of the molecular biology by PCR and DGGE. The results suggested that the combination of enzymatic and chemical methods could obtain the highest DNA yield and integrity， which was suitable for PCR， and the most abundant bands could be obtained by DGGE. This development of the highly effective DNA extraction method provided a foundation for studying in molecular ecology of soil microbes.

Key words： soil microbe； DNA extraction； PCR； DGGE

收稿日期：2013-05-10

作者简介：周伟（1981-），男，河南南阳人，讲师，主要从事遗传学方面的研究，（电话）13938025634（电子信箱）luohezhouwei@126.com。

微生物在土壤生态系统物质循环和能量转化过程中起重要作用，目前通过纯培养技术只能获得土壤中仅极少数的微生物种类，不能充分体现微生物群落的真实组成[1]。而基于DNA分析的分子生物学技术的引入，降低了对培养技术的依赖性，可以直接对土壤中微生物进行研究[2]。由于土壤中含有大量理化性质复杂的物质，而且微生物与土壤颗粒吸附紧密，不易从中提取DNA；同时土壤中微量的腐殖酸和重金属可能抑制分子生物学操作过程中酶的活性、降低转化效率以及DNA的杂交特异性[3，4]等。因此，从土壤样品中高效地获得高质量的DNA是后期土壤微生物分子生物学研究的前提。

土壤中微生物DNA提取的关键在于细胞的裂解，本研究通过对不同的裂解手段进行组合，设计了3种从土壤中直接提取微生物总基因组DNA的方法并对后期扩增效果进行比较分析，以期建立一种高效、简便的土壤微生物DNA提取方法，为分子水平上研究土壤微生物提供参考。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

2011年在河南省漯河市孟庙镇进行取样。供试土壤取自常年以冬小麦-春玉米茬口种植的农田，秸秆全部还田，采用五点取样法取土样，取样深度为0～20 cm，混匀后于-20 ℃保存。

1.2 试剂与仪器

溶菌酶、蛋白酶K购自Sigma公司，所用maker（λ-HindⅢ digested Marke，DNA Marker DL 2000）、凝胶回收试剂盒、PCR Kit购自TaKaRa公司。TGRADIENT温度梯度PCR仪为德国Biometra公司生产，全自动数码凝胶成像与分析系统由天能科技（上海）有限公司生产。

1.3 方法

对提取土壤微生物DNA方法中不同的细胞裂解方式进行组合，设计3种土壤基因组DNA的提取方法。

方法a：酶法与化学法相结合[5]。5 g土壤中加入25 μL蛋白酶K、13.5 mL TENC（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% CTAB），混匀后置于37 ℃摇床225 r/min震荡30 min；然后加入1.5 mL SDS混匀，65 ℃水浴震荡2 h；6 000 r/min离心15 min，取上清液。原离心管中加入9 mL TENC、1 mL SDS，混匀后水浴1 h，6 000 r/min离心15 min，取上清液。合并所得上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀后10 000 r/min离心15 min，取上清液，等体积加入异丙醇，混匀后放入冰箱中4 ℃过夜，10 000 r/min离心15 min，弃上清，加入2 mL预冷的70%乙醇洗涤2次，干燥后加入500 μL TE溶解。

方法b：化学法和冻融法结合使用[6]。5 g土壤中加入20 mL TENS（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% SDS），70 ℃水浴1 h，6 000 r/min离心10 min，取上清液。在沉淀中加入1.5 mL TEN（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl），放置在-20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反复冻融，循环5次。10 000 r/min离心10 min，取上清液。合并所得上清液，后续DNA溶解步骤与方法a相同。

方法c：酶法、化学法及冻融法配合使用[7]。5 g土壤中加入10 mL PBS，混匀后置于30 ℃摇床150 r/min震荡15 min，10 000 r/min离心20 min，弃上清液。取沉淀加裂解液Ⅰ（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、100 mmol/L EDTA）7.5 mL，50 mg/mL溶菌酶2.5 mL，37 ℃水浴2 h，10 000 r/min离心15 min取上清液。沉淀加裂解液Ⅱ（0.15 mol/L NaCl、0.5 mol/L Tris-HCl、10% SDS）10 mL，循环放置在 -20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反复冻融，循环3次，10 000 r/min离心15 min取上清液。合并上清液，后续DNA溶解步骤与方法a相同。

1.4 DNA质量与纯度的检测

提取的DNA通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，120 V电泳45 min，凝胶成像系统中观察结果并拍照。DNA纯度采用紫外分光光度计法进行比较，将所溶解的DNA溶液分别在230、260、280 nm波长下的吸光值进行测定。

1.5 不同提取方法对后期试验适用性的分析

对细菌保守的16 S rDNA基因以及其V3可变区进行扩增，并对V3可变区进行DGGE电泳，根据PCR扩增效果以及DGGE电泳分离结果进行比较，分析3种提取方法所获得的DNA是否适合后期分子生物学试验。

1.5.1 PCR扩增及电泳本试验所用16S rDNA引物为BR8-27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和BL1541-1522（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

-3′），V3可变区引物为338L（5′-CTACGGGAGGCA

GCAG-3′）/518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），可对所有真细菌及大部分古细菌的相应目的片段进行有效扩增。PCR反应体系（50 μL）：10×PCR Buffer（含Mg+）5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL，引物（10 mmol/L）各1 μL，Taq酶（5 U/μL） 1 μL，土壤 DNA 1 μL，超纯水定容至50 μL。16 S rDNA按以下循环程序扩增：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃延伸5 min。V3可变区按以下循环程序扩增：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35次循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，分别取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶上，80 V电压下电泳15 min，电泳结束后在凝胶成像系统中观察并拍照。

1.5.2 目的片段检测用Bio-Rad公司的D-Code system基因突变检测系统对V3可变区进行DGGE电泳分离，采用10%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度为40%～60%，加30 μL PCR产物，60 ℃，1×TAE，130 V电泳5 h，电泳凝胶采用银染方法显色。

2 结果与分析

2.1 基因组总DNA提取效果

利用3种方法提取土壤微生物DNA，电泳结果显示（图1）：方法a所得基因组DNA在23 130 bp左右出现一条较亮条带，说明提取的DNA较完整；方法b所得产物出现较大范围的弥散，表明DNA在提取过程中发生部分断裂，影响了DNA的完整性和质量；而方法c得到的产物分子量低于4 000 bp，且较为分散，表明DNA在提取过程断裂较为严重。

从土壤中提取的微生物DNA常含有蛋白质和腐殖酸，影响DNA的质量。OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm的值可分别检测DNA中蛋白质和腐殖酸的污染程度，一般认为OD260 nm/OD280 nm在1.5～2.1之间，OD260 nm/OD230 nm大于2.0时说明所获得的DNA具有较高纯度。表1中结果表明，方法a提取的土壤微生物DNA OD260 nm/OD280 nm比值与理论值接近，蛋白质污染较轻，而OD260 nm/OD230 nm偏低，说明所提取的DNA存在一定程度的腐殖酸污染。方法b和方法c所得DNA的两项比值均低于正常值，表明提取的土壤微生物DNA中腐殖酸含量较高，蛋白污染较严重。另外，OD260 nm数据显示方法a所得DNA有最大吸收值。结果表明，3种提取方法中方法a所得土壤微生物DNA的纯度和含量最高。

2.2 不同方法提取的DNA扩增效果检测

用16 S rDNA基因以及其V3区通用引物进行PCR扩增，3种提取方法所得DNA对目的基因的扩增效果如图2、图3所示，方法a所提土壤微生物DNA扩增得到的PCR产物亮度较高，表明其产量及浓度较高，而方法b所提DNA扩增得到的产物亮度要比方法a弱很多，表明产物的量较少，扩增效果稍差，而方法c所得DNA扩增得到目的产物并没有在电泳中观察到，可能是由于产物的量过低，或没有得到扩增，说明该方法提取的DNA质量较差。

2.3 PCR产物的DGGE电泳

通过DGGE电泳对扩增得到的16 S rDNA V3可变区进行分离，结果如图4所示。由方法a所获得的土壤微生物DNA经过PCR-DGGE电泳分离，能够得到13条不同强度的条带，而方法b所获得的DNA只分离出7条。通过比较可以看出，方法a所获得的分离条带明显较多，且分离结果清晰，通过DGGE电泳能够较好地体现土壤中细菌组成的丰富程度以及种群分布的差异，而方法b所体现的微生物种类相对较少，但相应条带所对应的种群密度与方法a保持一致。另外，方法b提取的DNA能够分离出方法a没有扩增到的条带，说明这2种提取方法对部分细菌的裂解能力存在差异。由此可以推测，不同方法对细菌DNA的提取存在一定程度的选择性，不可能完全体现出土壤中所有细菌的组成。

3 小结与讨论

土壤微生物DNA提取方法主要可分为细胞提取法[8]和原位裂解法[9]。细胞提取法是先将细胞从土壤中分离出来，然后通过细胞裂解提取DNA。该方法虽然可得到纯度较高的DNA，但由于绝大部分细菌与土壤颗粒吸附牢固，不宜洗脱，导致细胞产量低，提取的DNA量少，反映的微生物群落具有片面性。原位裂解法是直接对土壤样品进行裂解提取基因组DNA，该方法提取的DNA一般产量较高，能够更好地反映土壤中微生物的群落组成，但是由于在提取过程中会有一些土壤有机成分被提取出来，从而影响后期的分子生物学分析[10，11]。常用的原位裂解方法包括化学法、酶法或物理法，各种方法的作用原理不同，因而其提取效果也各有差异。化学法主要通过化学试剂对细胞进行破碎和DNA抽提，酶法主要通过酶的作用造成细胞裂解，而物理法则是通过外力作用使细胞破裂，本试验采用的3种方法分别基于不同的裂解原理进行组合。

在这3种裂解原理中，化学法相对温和，但对不同类型细胞裂解能力不同；酶法对细胞破裂具有专一性，但活性易受土壤中化学成分的影响；物理方法能彻底破碎细胞，但裂解时对DNA剪切程度比较大[12，13]，本试验的结果也证实了以上结论。化学试剂与酶的联合使用，能够对土壤中的DNA进行有效的裂解。由于化学裂解过程比较温和，蛋白酶不但提高了对细胞的破碎能力，又降解了部分蛋白质，从而较好地保证了整个基因组DNA的完整性和纯度。而在化学裂解过程中进行冻融，能够使细胞充分破碎，DNA得率较高，但同时造成DNA断裂。化学、物理和酶法联合使用，虽然对细胞裂解效果较好，但同时使DNA片段大量断裂，造成DNA的质量与提取效率过低。另外，CTAB法对去除蛋白质和其他污染物有较好的效果，使方法a所获得的DNA纯度较其他两种方法要高。DNA质量的差异造成了以方法a为模板的扩增效果明显优于其他两种方法，扩增产物含量和质量均比较高，有利于后期分析试验的进行。通过对3种方法提取土壤微生物DNA效果的电泳检测比较，用2种不同引物对PCR扩增结果以及DGGE电泳结果进行比较，表明化学法和酶法联合使用适宜提取土壤微生物的DNA。

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（责任编辑赵娟）