转玉米PEPC基因水稻的形态和光合酶活性变化

李万昌+王丹+王俊伟+姬生栋

摘要：以稳定的转PEPC基因水稻和未转PEPC基因水稻为供试材料，对其外形和光合酶活性进行测定。结果表明，与未转PEPC基因水稻相比，转PEPC基因水稻株高增加、茎秆变粗、叶片变宽、根系发达，光合酶活性增加，且产量构成因素均增加。

关键词：水稻；PEPC基因；光合酶活性

中图分类号：S511.036 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0023-02

Morphology and Photosynthetic Enzyme Activity of Maize PEPC Transgenic Rice

LI Wan-chang，WANG Dan，WANG Jun-wei，JI Sheng-dong

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： The agronomic traits and photosynthetic enzymes activity were studied in maize PEPC transgenic rice and the untransformed rice. The results showed that the plant height was higher， the stalk was stronger， the leaf was wider， the root system was more exuberant than that of the untranformed rice. The photosynthetic enzyme activity was increased and the yield components were improved in PEPC transgenic rice.

Key words： rice； PEPC gene； photosynthetic enzyme activity

收稿日期：2013-04-07

基金项目：河南省科技攻关项目（102102310318）；国家自然科学基金项目（1304317）

作者简介：李万昌（1974-），男，河南汝州人，副教授，博士，主要从事作物遗传育种研究，（电话）13264591533（电子信箱）li_wan_chang@163.com。

叶片经强光照射导致光合效率长期降低的现象称为光抑制，在C3植物中有较高的光呼吸，光抑制是普遍现象，水稻的光抑制现象经常发生。而C4植物同化CO2的途径为C4光合途径，具有浓缩CO2的机制，特别在高光、高温和干旱条件下，具有较高的光合能力和养分利用效率。因此，将C4植物的光合基因转入C3植物水稻中以提高其光合能力的研究备受关注[1]。早期人们曾试图用常规杂交的方法将C4植物的性状转移到C3植物中[2]， 但未获得成功。近年来，随着分子生物学技术的发展，用农杆菌转化系统将转磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）导入水稻，获得了一些高表达的转基因水稻植株[3，4]。本试验以未转PEPC基因水稻和高表达转PEPC基因水稻为材料，对转基因水稻的外形和光合酶活性的变化进行研究，为应用生物技术进行水稻的遗传改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以粳稻品种新稻18为基因受体，导入玉米的PEPC基因，获得不同的转基因水稻材料，这些材料盆栽于河南师范大学水稻育种试验地，在自然温光条件下按常规管理。

1.2 酶液的提取和酶活性的测定

取水稻叶片2 g 在Tris-HCl 缓冲液中冰浴研磨，8 层纱布过滤后，将滤液在低温高速离心机上于4 ℃下10 000 g离心20 min，弃沉淀，上清液即为酶液。C4 光合酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的酶活测定参照Gonzalez等[5]的方法，碳酸酐酶（CA）活性测定按照郭敏亮等[6]的方法，NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）的活性测定参照李斌等[7]的方法，RuBP羧化酶（RuBPC）活性的测定参照Kung等[8]的方法。

2 结果与分析

2.1 供试材料的形态比较

将玉米的PEPC基因导入水稻后，获得了一系列形态各异的转基因株系。与对照新稻18相比，转基因株系的株高变高，根系发达（图1），叶片变宽，茎秆变粗（图2）。转基因株系的单株有效穗数、穗长、千粒重和单株产量与对照相比分别提高了30.2%、7.5%、8.9%和32.1%。可见外形的变化和产量构成因素的增加密切相关。

2.2 转基因水稻与对照叶片光合酶活性的比较

在正常光照条件[光照350 μmol/（m2·s），21% O2，350 μL/L CO2，30 ℃，3 h]下，测定了对照和转基因株系的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、碳酸酐酶（CA）、NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）和RuBP羧化酶（RuBPC）的活性。发现转基因株系PEPC的活性明显高于对照，而CA、NADP-MDH和RuBPC的活性与对照相近（图3A）。在光抑制条件[光照1 000 μmol/（m2·s），2% O2，60 μL/L CO2，30 ℃，3 h]下，转基因株系中RuBPC的活性与对照相比增加了5%左右（两者差异不显著），而转基因株系中PEPC、CA和NADP-MDH的活性比各自对照分别增加了282.3%、23.1%和25.6%（图3B）。说明在光抑制条件下，转基因水稻中除了PEPC活性增加外，其他C4光合酶也诱导增加，并且高于各自对照。可见，转基因株系中，不论何种条件下，PEPC的酶活都高于对照，可以大大提高光合效率。

3 讨论

长期以来人们对C3植物中是否存在C4光合途径一直持怀疑态度，因为C4植物叶片具有特殊的Kranz结构，而C3植物中没有这样的结构。但早有报道在C3作物大豆[9]、小麦[10]、水稻[11]叶片中有C4光合酶系统。将C4循环酶基因导入C3作物被认为是提高作物光合效率和发挥产量潜力的重要途径。陈根云等[12]的研究发现，向C3植物菠菜中外加C4光合原初产物草酰乙酸或苹果酸可提高叶片的光合能力，为在C3植物中建立C4微循环系统来提高光合效率的可能性提供了依据。

常规育种→生理育种→生物技术育种是作物育种的发展趋势[13]，其中高光效生理育种是当代植物生理和育种工作者共同关注的问题，特别是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。为探明水稻中C4微循环及其生理功能，将玉米的高光效基因PEPC导入到新稻18中，获得了一系列株高增加、根系发达、叶片变宽、茎秆增粗的转基因株系。与对照相比，这些转基因株系的生物学产量和经济产量均增加，并且其光合酶活性也大大增强，这与焦德茂等[16]的研究结果一致。周宝元等[17]研究发现PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究发现干旱胁迫下PEPC过表达增强水稻的耐强光能力，这和本研究转基因植株的根系发达、茎秆增粗的形态变化相一致。转基因株系的外形变化可能是转PEPC基因水稻抗逆增产的生理基础。因此，在现有良好株型和杂种优势利用的基础上，通过遗传操作将C4光合酶基因导入我国高产水稻品种中，将开拓一条新的水稻育种途径。

参考文献：

[1] MATSUOKA M， FURBANK R T， FUKAYAMA H， et al. Molecular engineering of C4 photosynthesis[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52：297-314.

[2] BROWN R H， BOUTON J H. Physiology and genetics of interspecific hybrids between photosynthetic types[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1993，44：435-456.

[3] AGRIE S， TSUCHIDA H， KU M S B. High Level Expression of C4 Enzymes in Transgenic Rice Plant[M]. Domdrecht， Netherland： Kluwer Academic Publishers，1998.

[4] KU M S B， AGARIE S， NOMURA M， et al. High level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxlase in transgenic rice plants[J].Nature Biotech，1999，17：76-80.

[5] GONZALEZ D H， IGLESIAS A A， ANDEO C S. On the regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase activity from maize leaves by L-malate： Effect of pH[J]. J Plant Physiol，1984， 116：425-434.

[6] 郭敏亮，高煜珠，王 忠.用酸度计测定植物碳酸酐酶活性[J].植物生理学通讯，1988（6）：59-61.

[7] 李 斌，陈冬兰，施教耐.高粱NADP苹果酸脱氢酶的纯化及其分子特性[J]. 植物生理与分子生物学学报，1987，13（2）：113-121.

[8] KUNG S D，CHOLLET R， MARSHO T V. Crystallization and assay procedures of tobacco ribulose 1，5-bisphosphate carboxlase-oxygenase[A]. PIETRO A S. Method in Enzymology[C]. New York： Academic Press Inc，1980.

[9] 李卫华，卢庆陶，郝乃斌，等. 大豆叶片C4循环途径酶[J].植物学报，2001，43（8）：805-808.

[10] HATA S， MATSUOKA M. Immunological studies on pyruvate orthophosphate dikinase in C3 plants[J]. Plant Cell Physiol，1987，28：635-641.

[11] 王 强，卢从明，张其德，等.超高产杂交稻两优培九的光合作用、光抑制和C4途径酶特性[J].中国科学（C辑），2002，45（5）：468-476.

[12] 陈根云，叶济宇.草酰乙酸和苹果酸对菠菜叶片和完整叶绿体光合作用的影响[J].植物生理学报，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

[14] KU M S B， KANO-MURAKAMI Y， MATSUOKA M. Evolution and expression of C4 photosynthesis genes[J]. Plant Physiol，1996，111：949-957.

[15] EDWARDS G. Tuning up crop photosynthesis[J]. Nature Biotechnology，1999，17（1）：22-23.

[16] 焦德茂，李 霞，黄雪清，等.转PEPC基因水稻的光合CO2同化和叶绿素荧光特性[J].科学通报，2001，46（5）：414-418.

[17] 周宝元，丁在松，赵 明.PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用[J]. 作物学报，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周宝元，孙雪芳，等.干旱胁迫下PEPC过表达增强水稻的耐强光能力[J].作物学报，2012，38（2）：285-292.

（责任编辑 郑 威）

3 讨论

长期以来人们对C3植物中是否存在C4光合途径一直持怀疑态度，因为C4植物叶片具有特殊的Kranz结构，而C3植物中没有这样的结构。但早有报道在C3作物大豆[9]、小麦[10]、水稻[11]叶片中有C4光合酶系统。将C4循环酶基因导入C3作物被认为是提高作物光合效率和发挥产量潜力的重要途径。陈根云等[12]的研究发现，向C3植物菠菜中外加C4光合原初产物草酰乙酸或苹果酸可提高叶片的光合能力，为在C3植物中建立C4微循环系统来提高光合效率的可能性提供了依据。

常规育种→生理育种→生物技术育种是作物育种的发展趋势[13]，其中高光效生理育种是当代植物生理和育种工作者共同关注的问题，特别是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。为探明水稻中C4微循环及其生理功能，将玉米的高光效基因PEPC导入到新稻18中，获得了一系列株高增加、根系发达、叶片变宽、茎秆增粗的转基因株系。与对照相比，这些转基因株系的生物学产量和经济产量均增加，并且其光合酶活性也大大增强，这与焦德茂等[16]的研究结果一致。周宝元等[17]研究发现PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究发现干旱胁迫下PEPC过表达增强水稻的耐强光能力，这和本研究转基因植株的根系发达、茎秆增粗的形态变化相一致。转基因株系的外形变化可能是转PEPC基因水稻抗逆增产的生理基础。因此，在现有良好株型和杂种优势利用的基础上，通过遗传操作将C4光合酶基因导入我国高产水稻品种中，将开拓一条新的水稻育种途径。

参考文献：

[1] MATSUOKA M， FURBANK R T， FUKAYAMA H， et al. Molecular engineering of C4 photosynthesis[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52：297-314.

[2] BROWN R H， BOUTON J H. Physiology and genetics of interspecific hybrids between photosynthetic types[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1993，44：435-456.

[3] AGRIE S， TSUCHIDA H， KU M S B. High Level Expression of C4 Enzymes in Transgenic Rice Plant[M]. Domdrecht， Netherland： Kluwer Academic Publishers，1998.

[4] KU M S B， AGARIE S， NOMURA M， et al. High level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxlase in transgenic rice plants[J].Nature Biotech，1999，17：76-80.

[5] GONZALEZ D H， IGLESIAS A A， ANDEO C S. On the regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase activity from maize leaves by L-malate： Effect of pH[J]. J Plant Physiol，1984， 116：425-434.

[6] 郭敏亮，高煜珠，王 忠.用酸度计测定植物碳酸酐酶活性[J].植物生理学通讯，1988（6）：59-61.

[7] 李 斌，陈冬兰，施教耐.高粱NADP苹果酸脱氢酶的纯化及其分子特性[J]. 植物生理与分子生物学学报，1987，13（2）：113-121.

[8] KUNG S D，CHOLLET R， MARSHO T V. Crystallization and assay procedures of tobacco ribulose 1，5-bisphosphate carboxlase-oxygenase[A]. PIETRO A S. Method in Enzymology[C]. New York： Academic Press Inc，1980.

[9] 李卫华，卢庆陶，郝乃斌，等. 大豆叶片C4循环途径酶[J].植物学报，2001，43（8）：805-808.

[10] HATA S， MATSUOKA M. Immunological studies on pyruvate orthophosphate dikinase in C3 plants[J]. Plant Cell Physiol，1987，28：635-641.

[11] 王 强，卢从明，张其德，等.超高产杂交稻两优培九的光合作用、光抑制和C4途径酶特性[J].中国科学（C辑），2002，45（5）：468-476.

[12] 陈根云，叶济宇.草酰乙酸和苹果酸对菠菜叶片和完整叶绿体光合作用的影响[J].植物生理学报，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

[14] KU M S B， KANO-MURAKAMI Y， MATSUOKA M. Evolution and expression of C4 photosynthesis genes[J]. Plant Physiol，1996，111：949-957.

[15] EDWARDS G. Tuning up crop photosynthesis[J]. Nature Biotechnology，1999，17（1）：22-23.

[16] 焦德茂，李 霞，黄雪清，等.转PEPC基因水稻的光合CO2同化和叶绿素荧光特性[J].科学通报，2001，46（5）：414-418.

[17] 周宝元，丁在松，赵 明.PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用[J]. 作物学报，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周宝元，孙雪芳，等.干旱胁迫下PEPC过表达增强水稻的耐强光能力[J].作物学报，2012，38（2）：285-292.

（责任编辑 郑 威）

3 讨论

长期以来人们对C3植物中是否存在C4光合途径一直持怀疑态度，因为C4植物叶片具有特殊的Kranz结构，而C3植物中没有这样的结构。但早有报道在C3作物大豆[9]、小麦[10]、水稻[11]叶片中有C4光合酶系统。将C4循环酶基因导入C3作物被认为是提高作物光合效率和发挥产量潜力的重要途径。陈根云等[12]的研究发现，向C3植物菠菜中外加C4光合原初产物草酰乙酸或苹果酸可提高叶片的光合能力，为在C3植物中建立C4微循环系统来提高光合效率的可能性提供了依据。

常规育种→生理育种→生物技术育种是作物育种的发展趋势[13]，其中高光效生理育种是当代植物生理和育种工作者共同关注的问题，特别是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。为探明水稻中C4微循环及其生理功能，将玉米的高光效基因PEPC导入到新稻18中，获得了一系列株高增加、根系发达、叶片变宽、茎秆增粗的转基因株系。与对照相比，这些转基因株系的生物学产量和经济产量均增加，并且其光合酶活性也大大增强，这与焦德茂等[16]的研究结果一致。周宝元等[17]研究发现PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究发现干旱胁迫下PEPC过表达增强水稻的耐强光能力，这和本研究转基因植株的根系发达、茎秆增粗的形态变化相一致。转基因株系的外形变化可能是转PEPC基因水稻抗逆增产的生理基础。因此，在现有良好株型和杂种优势利用的基础上，通过遗传操作将C4光合酶基因导入我国高产水稻品种中，将开拓一条新的水稻育种途径。

参考文献：

[1] MATSUOKA M， FURBANK R T， FUKAYAMA H， et al. Molecular engineering of C4 photosynthesis[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52：297-314.

[2] BROWN R H， BOUTON J H. Physiology and genetics of interspecific hybrids between photosynthetic types[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1993，44：435-456.

[3] AGRIE S， TSUCHIDA H， KU M S B. High Level Expression of C4 Enzymes in Transgenic Rice Plant[M]. Domdrecht， Netherland： Kluwer Academic Publishers，1998.

[4] KU M S B， AGARIE S， NOMURA M， et al. High level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxlase in transgenic rice plants[J].Nature Biotech，1999，17：76-80.

[5] GONZALEZ D H， IGLESIAS A A， ANDEO C S. On the regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase activity from maize leaves by L-malate： Effect of pH[J]. J Plant Physiol，1984， 116：425-434.

[6] 郭敏亮，高煜珠，王 忠.用酸度计测定植物碳酸酐酶活性[J].植物生理学通讯，1988（6）：59-61.

[7] 李 斌，陈冬兰，施教耐.高粱NADP苹果酸脱氢酶的纯化及其分子特性[J]. 植物生理与分子生物学学报，1987，13（2）：113-121.

[8] KUNG S D，CHOLLET R， MARSHO T V. Crystallization and assay procedures of tobacco ribulose 1，5-bisphosphate carboxlase-oxygenase[A]. PIETRO A S. Method in Enzymology[C]. New York： Academic Press Inc，1980.

[9] 李卫华，卢庆陶，郝乃斌，等. 大豆叶片C4循环途径酶[J].植物学报，2001，43（8）：805-808.

[10] HATA S， MATSUOKA M. Immunological studies on pyruvate orthophosphate dikinase in C3 plants[J]. Plant Cell Physiol，1987，28：635-641.

[11] 王 强，卢从明，张其德，等.超高产杂交稻两优培九的光合作用、光抑制和C4途径酶特性[J].中国科学（C辑），2002，45（5）：468-476.

[12] 陈根云，叶济宇.草酰乙酸和苹果酸对菠菜叶片和完整叶绿体光合作用的影响[J].植物生理学报，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

[14] KU M S B， KANO-MURAKAMI Y， MATSUOKA M. Evolution and expression of C4 photosynthesis genes[J]. Plant Physiol，1996，111：949-957.

[15] EDWARDS G. Tuning up crop photosynthesis[J]. Nature Biotechnology，1999，17（1）：22-23.

[16] 焦德茂，李 霞，黄雪清，等.转PEPC基因水稻的光合CO2同化和叶绿素荧光特性[J].科学通报，2001，46（5）：414-418.

[17] 周宝元，丁在松，赵 明.PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用[J]. 作物学报，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周宝元，孙雪芳，等.干旱胁迫下PEPC过表达增强水稻的耐强光能力[J].作物学报，2012，38（2）：285-292.

（责任编辑 郑 威）