生物技术在苎麻研究及育种中的应用

王富强，龚秋林，潘其辉，张 萍，吴艳，陈晓蓉

(江西省麻类科学研究所，江西宜春 336000)

苎麻(Boehmeria nivea L.)别名野麻、白麻、青麻等，又被称为“中国草”，属荨麻科苎麻属，是原产于我国的特色纺织纤维原料作物。苎麻纤维织物质地轻、透气性好、吸湿散湿、吸热散热快，而且具有防腐防霉变的特点，主要用于制作夏布、汽车座套以及加工成高档纺织品等，被誉为“天然纤维之王”，是我国仅次于棉花的第2大纤维作物。虽作为我国的特色优势传统产业，苎麻产业却很容易受到国际市场的影响，国际市场的不断大幅波动直接影响了苎麻产业的发展。

在国内，苎麻的研究主要集中在湖南、湖北、江西和四川等地。目前，苎麻生产制造业正面临着加工设备落后、脱胶技术工艺落后、污染严重、人工成本较高等一系列问题［1］。近年来，整个苎麻产业的不景气，直接导致了麻农的种麻积极性严重下降，苎麻生物技术正逐渐取代苎麻常规育种而成为苎麻研究的新动力。笔者对苎麻研究中生物技术的应用进行简要综述，现报道如下。

1 组织培养

组织培养技术在苎麻中的研究始于1979年［2］。在随后的十几年中，研究主要集中在苎麻快繁、花药培养、茎尖脱毒和原生质体培养、保存野生苎麻品种等方面。随着近年来苎麻产业的急剧萎缩，苎麻压条以及营养钵扦插技术的出现，利用组织培养进行快繁已基本失去了在生产中的实际意义，同时茎尖脱毒和原生质体培等技术养取得的实用成效不明显，应用也不多。近年来，研究重点主要集中在建立苎麻转基因高频转化体系中，现已经建立起了一系列包括愈伤组织和子叶、下胚轴、茎段、茎尖、叶片以及腋芽等外植体再生植株体系，为转基因在苎麻中的利用发展解决了最基础的问题。

苎麻是杂合体，直接利用种子繁育会发生性状分离，通常采用无性繁殖的方式进行田间生产扩繁。研究中外植体取材一般直接取用研究苎麻品种(系)的植株组织，苎麻表面绒毛较多，外植体消毒成功率不高，较常用的外植体组织包括茎尖、嫩叶等。苎麻无菌苗的获得是组织培养研究的基础，无菌苗相对于直接用外植体消毒有很大的优势［3］，通过反复切取茎段可以获得大量的苗，同时因为苎麻叶片含有大量的酚类物质，从田间取材的叶片提取DNA的纯度不高，而利用苎麻无菌苗叶片提取的DNA则可明显的改善这一问题，这也是苎麻组织培养的一个利用途经。

2 无融合生殖

植物无融合生殖是介于有性生殖与无性生殖之间不经过受精卵而直接形成种子的一种特殊的生殖方式。其二倍体子代基因型与母本相同，可用于固定杂种优势及遗传育种研究，可以很大限度地固定杂种优势而不会出现性状分离，这不仅可以节省每年大量的杂交制种的花费，更有利于新奇的、未被充分利用的种质的快繁［4］。同时，苎麻无融合生殖的研究在苎麻的起源及进化研究中也具有很重要意义［5－6］。从事苎麻无融合生殖研究利用的人员较少，主要有中国农业科学院麻类研究所的臧巩固教授、熊和平院士以及华中农业大学的彭定祥教授等。

20世纪90年代初，臧巩固等发现了苎麻属植物的无融合生殖现象，随后便进行了野生苎麻属无融合生殖种质资源的收集与整理工作，经过20多年的努力，现已经在国内收集到6个专性无融合生殖种［7］。苎麻无融合生殖研究工作者的研究主要集中在苎麻无融合生殖的诱导与利用［8－9］、悬铃叶苎麻染色体行为［6］与无融合生殖基因以及其类型起源的遗传基础研究等。臧巩固等对其收集到的6个苎麻属植物专性无融合生殖种通过胚胎学鉴定出其属二倍体孢子生殖类型，并且他们还发现了在自然界罕见的情况，在同一山坡上苎麻属同一种内专性无融合生殖类型与专性有性生殖二倍体类型并存，它们外部形态几乎相同。这意味着臧巩固等不仅发现了该苎麻属植物无融合生殖类型的发源地以及其有性生殖祖先;这发现也同时表明控制该苎麻属植物无融合生殖发生的可能是由基因点突变所引起的［7］。这个重要发现为苎麻的无融合生殖研究提供了难得的理想材料，但截至目前，他们利用种间杂交的方式来试图转移无融合生殖基因的方法还未成功。

华中农业大学的彭定祥、刘立才等在悬铃叶苎麻中也发现了4个与生殖调控相关基因可能参与苎麻无融合生殖，李延坤等也利用mRNA差异显示对悬铃叶苎麻无融合生殖相关基因进行了初步筛选工作［10］，中国农科院麻类研究所就苎麻无融合生殖的研究已开展了一系列的分子生物学研究。

3 分子标记辅助育种

苎麻分子标记的研究起步较晚，以建立各分子标记反应体系和筛选各分子标记引物为主，已经应用在苎麻中的分子标记主要有 SSR、ISSR、RAPD、SRAP、AFLP和 RSAP等。研究主要集中在苎麻当家栽培品种与野生种质资源的分析利用［11］、苎麻属内亲缘关系及遗传多样性研究、苎麻系统发育关系及居群遗传学研究［12］、苎麻雄性不育［13］、自交后代纯度分析［14］以及无融合生殖［15］等。分子标记技术在苎麻中的应用有助于挖掘苎麻特别是野生苎麻品种中的优良基因，同时也为研究苎麻属的亲缘关系等方面提供了更加准确的方法。

4 转基因技术

转基因技术在苎麻育种中应用相对较晚。从1983年世界上首例转基因植物—烟草的诞生，到10年后才获得了世界上第一例转基因苎麻。目前，在苎麻上应用的转基因方法有农杆菌介导的遗传转化法、基因枪转化法、超干胚浸渍法和花絮侵入法等。

1993年，Dusi等［16］用农杆菌介导法将一个与蛋白质相关联的基因导入到饲用苎麻中，获得经GUS标记检测与Southem杂交检测呈阳性植株。2005年，陈建荣等［17］优化并建立了苎麻根癌农杆菌介导的遗传转化体系，获得了卡那霉素抗性植株。随后，易自立等［18］用以“湘苎二号”下胚轴为受体，将BT基因成功导入到苎麻中。孔华等［19］采用叶盘法将含轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因导入到苎麻圆叶青中，并获得经PCR及Southemblot分析呈阳性植株。汪波等［20］将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入到苎麻中，对抗性植株的GFP荧光检测和Southemblot分析结果显示，外源基因已经成功整合到苎麻基因组中。至2009年，符家平等对苎麻转PsAG12-IPT基因和BT基因的分子检测及性状考察，首次对转BT基因苎麻卢竹青T0和T1代植株进行室内抗虫鉴定以及大田主要农艺性状和品质性状考察，结果显示转BT基因植株不仅在T0到T1代稳定遗传，而且T1代植株的大田抗虫性明显优于非转基因对照植株［21－23］。2010 年马雄风［24］和宫本贺［25］分别用农杆菌介导法和基因枪法将双价抗虫基因(CryIA+CpTI)成功导入到苎麻中，宫本贺对转化植株的T0代植株进行了检测和筛选以及相关抗虫性的鉴定，同时还对T1代目的基因的稳定性进行了检测。

近年来，苎麻再生与苎麻农杆菌介导法及基因枪法转基因体系不断得到优化，为转基因技术在苎麻中的应用不断奠定基础。

5 倍性育种

5.1 单倍体育种 单倍体育种有2大优点:缩短育种周期和提高隐性基因的选择效率。主要方法有花药培养、用未受粉子房进行离体培育、无融合生殖和双胚苗等。单倍体育种在苎麻中研究较少，主要有花药离体培养和无融合生殖培养等。

1990年，颜昌敬等［26］对“芦竹青”、“湘竺 l号”和“诸暨”三个品种进行了花粉培养，经过培养条件的优化，首次通过苎麻花药培养获得了再生植物。1994年，刘国民等［27］研究了外源激素在苎麻花药培养中的作用，他指出了苎麻花药愈伤组织的诱导必需添加外源激素，通过细胞学观察发现外源激素能够促进更多花粉启动雄核发育，同时在花粉多细胞团突破花粉壁形成愈伤组织的过程中是必需存在的。2007年，孙珍夏［28］对谈家河麻等13个品种材料的花药愈伤组织培养进行了研究，初步形成了一套从苎麻花药离体培养愈伤组织到愈伤组织倍性鉴定的完整体系，为以后的研究奠定了一定的基础。

5.2 多倍体育种 苎麻种植主要以扦插、压条等无性繁殖方法为主，刚好可以利用多倍体育种中常出现的种子结实率低的问题，同时多倍体植株一般具有植株高大和抗逆性强等特点，这正是作为韧皮纤维作物所需要的。

利用多倍体育种来改良现有苎麻主栽品种，还具有见效快、耗时短和收益大等特点。常用的方法为利用不同浓度的秋水仙素对苎麻不同部位及种子进行诱导。

早在20世纪60年代，我国台湾省的C.Y.Chi和M.IJ.Lai就报道了利用秋水仙素以苎麻“南方绿皮种”种子为材料进行诱变，同时探讨了不同秋水仙素的处理浓度与时间对处理效果的影响。当时，他们还曾以“南华青皮”为亲本材料，诱导出四倍体品系Me-60-2和Me-60-11。20世纪80年代初，谢卓荣等［29］研究了以不同浓度的秋水仙素分别对苎麻试管苗、地下茎和种子进行处理来诱导多倍体，在次年以“黄壳早”和“芦竹青”品种成功诱导出43株多倍体单株，同时也指出了苎麻各不同处理部位的秋水仙素适宜使用浓度以及总结了各处理方法的优缺点。1989年，中国农业科学院麻类研究所获得了苎麻多倍体植株。湖南农学院也在随后的3年内使用1%浓度的秋水仙素处理苎麻，方法包括诱导苎麻种子浸渍法、滴生长点、定量注射法和组织培养法，最终获得50多株多倍体植株进行扩大繁殖。1990年，潘昌立等［30］以“湘竺二号”等18个品种(系或组合)为材料，比较了不同浓度的秋水仙素以及不同的处理时间对苎麻不同器官或部位的诱导效果。试验结果显示，诱导材料选择子叶期实生苗茎尖最佳，早期诱导率便达到9.04%，为当时国内已报道的5倍。同时，他还提出了鉴定多倍体的简单方法:首先根据多倍体苎麻特征特性表型进行大田目测观察，然后结合花粉镜检初选，最后再以染色体技术为准，可提高多倍体苎麻的筛选效率。

6 诱变育种

诱变育种，是利用理化因素诱导变异，再通过选择而培育新品种的育种方法。辐射诱变的研究始于20世纪20年代，我国从60年代中期开始在水稻、小麦、大豆等作物上利用辐射诱变育成新品种。据国际原子能机构(IAEA)统计，截止到2008年全世界通过辐射已育成2 775个植物品种。目前，笔者仅查阅到Co60-γ射线照射和航天育种2种物理诱变方法在苎麻育种中的研究报道。

6.1 核辐射 20世纪70年代初，中国农科院麻类研究所率先进行了苎麻核辐射诱变育种研究。以Co60-γ射线为辐射源，利用湘苎一号自交种子为材料，1974年从0.5万伦琴辐照后代群体中选出编号为“74－69”的优良变异单株，随后由于综合性状优良并且稳定，经过篼系、品系比较试验以及全国区域试验。另外一个品种“圆叶青”也在1984年通过技术审定。1990年，2个品种通过全国农作物品种委员会审定［31］。湖南大学从1981年开始也进行了辐射诱变育种工作，选育出了一些品系但最终未获得新品种［32］。

6.2 航天育种 航天育种作为作物育种的新型领域，具有比地面核辐射诱变育种变异大、突变多以及稳定快等特点，正在受到越来越多的亲睐，并且已经有太空辣椒、茄子、番茄等作物获得成功并推广。

2002年12月，江西省麻类研究所将苎麻“赣苎三号”种子搭载“神舟四号”飞船送上太空，并在接下来的2年中对其出苗率、成苗率以及植物学形状进行观察以及筛选。结果显示，航天种子的发芽率降低，植物学性状有明显变异，最后经筛选得到23株植物学性状较优良的单株［33］。经过长期筛选，留下一个相对较为优良的品系，并且利用其进行了杂交育种，获得了一个较为稳定的杂交后代，个别性状仍在改良中［34］。

2008年，湖南农业大学苎麻研究所将具有孤雌生殖和高细度纤维性状的苎麻后代种子搭载“神舟七号”太空飞船送入太空诱变，随后对诱变材料农艺性状及纤维细度、纤维产量等进行了评估，结果显示供试的12份材料纤维细度高于对照“湘苎三号”，但纤维产量却有所降低。其中，品系XR02综合品质最好，纤维产量可达3 915 kg/hm2，纤维细度达2 679 m/g;品系XR12纤维细度最高，达到2 720 m/g，这些材料可作为今后育种材料利用［35］。

我国的航天育种仍处在探索阶段，在苎麻育种上应用目前尚未取得成功，还没有选育出优良的新品种，需要我们苎麻育种研究工作者投入更大的努力。

7 小结与展望

目前苎麻产业整体低迷，苎麻育种工作也因此缺乏研究动力，同时基层研究经费少，研究工作重心从苎麻育种逐渐转移到苎麻细胞、分子水平上的基础研究以及利用生物技术开发苎麻新用途，诸如将超量表达金属硫蛋白或植物络合素基因转化到苎麻中，提高苎麻吸收重金属镉的能力，将苎麻培育成治理重金属污染的目标植物，同时也能收获苎麻纤维获得一定的经济效益。

生物技术的应用，为苎麻研究带来了新的方法和方向，同时也带来了新的机遇和挑战。生物技术在苎麻研究中应用很多，带来的直接经济效益却不理想，因此培育出更多好品种，同时不断大力提高苎麻制造工艺水平，解决苎麻脱胶污染问题，加紧开发苎麻多用途利用等是目前面临的紧迫问题。

［1］龚秋林.江西省苎麻企业现状与对策［J］.中国麻业科学，2011(1):49－52.

［2］周朴华，李宗道，徐桥生.苎麻组织培养简报［J］.中国麻作，1980(1):31－32.

［3］郭运玲，郭安平，刘恩平，等.苎麻茎尖的组织培养及其诱导植株的再生［J］.热带作物学报，2006(1):73－76.

［4］HANNA W W，DUJARDIN M，OZIAS-AKINS P，et al.Transfer of Apomixes in Pennisetum［C］//ELGIN J H JR，MIKSCHE J P.Proceedings of apomixes workshop.USDA-ARS，1992:30 －33.

［5］陈建华，许英，王晓飞，等.苎麻属植物资源基础研究进展［J］.植物遗传资源学报，2011(3):346－351.

［6］邱财生，程超华，赵立宁，等.无融合生殖悬铃叶苎麻(Boehmeria tricuspis)多倍性发生的染色体行为研究［J］.植物遗传资源学报，2013，14(3):227－231.

［7］曹雪琴.追梦无融合生殖——记中国农业科学院麻类研究所研究员臧巩固［J］.科学中国人，2012(15):46－47.

［8］彭定祥，刘立山.苎麻无融合生殖诱导初步研究［J］.武汉:华中农业大学学报，1999(3):5 －6.

［9］孙立才.苎麻诱导无融合生殖与化学杀雄试验研究［D］.武汉:华中农业大学，2001.

［10］李彦坤.mRNA差异显示筛选悬铃叶苎麻无融合生殖相关基因的基础研究［D］.北京:中国农业科学院，2011.

［11］刘立军.苎麻种质资源遗传多样性及分子标记研究［D］.华中农业大学，2008.

［12］张瑾，李同建，曹彬，等.苎麻EST-SSR引物开发和高多态性位点分析［J］.江苏农业科学，2012(3):25 －27.

［13］丁明忠.苎麻雄性不育的遗传机理及应用研究［D］.雅安:四川农业大学，2008.

［14］谭龙涛.苎麻自交纯合进度评价研究［D］.北京:中国农业科学院，2012.

［15］邱财生.悬铃叶苎麻无融合生殖类型起源的遗传基础研究［D］.北京:中国农业科学院，2006.

［16］DUSI D M A，ALMEIDA M D E R P，CALDAS L S，et al.Transgenic plants of ramie(Boehmeria nivea Gaud.)obtained by Agrobacterium mediated transformation［J］.Plant Cell Rep，1993，12:625 －628.

［17］陈建荣，郭清泉，张学文，等.农杆菌介导苎麻叶片遗传转化体系的研究［J］.中国农学通报，2005(6):63－66.

［18］易自力，李祥，蒋建雄，等.苎麻再生体系的建立及抗虫转基因苎麻的获得［J］.中国麻业，2006(2):61－66.

［19］孔华，郭安平，章霄云，等.苎麻遗传转化再生体系的建立［J］.分子植物育种，2006(2):233－237.

［20］汪波，彭定祥，孙珍夏，等.根癌农杆菌介导苎麻转绿色荧光蛋白(GFP)基因植株再生［J］.作物学报，2007(10):1606－1610.

［21］符家平，汪波，洪果，等.转PSAG12-IPT基因苎麻株系T0代性状考查［J］.中国麻业科学，2009(4):225 －227，241.

［22］符家平，汪波，王辉，等.转PSAG12-IPT基因苎麻株系光合性能研究［J］.湖北农业科学，2009(1):63 －65.

［23］符家平，汪波，刘立军，等.根癌农杆菌介导转Bt基因苎麻的获得及其抗虫鉴定［J］.作物学报，2009(10):1771－1777.

［24］MA X F，YU C M，TANG S W.Genetic transformation of the bast fiber plant ramie(Boehmeria nivea Gaud.)via Agrobacterium tumefaciens［J］.Plant Cell Tiss Organ Cult，2010，100:165 －174.

［25］宫本贺，熊和平，马雄风，等.基因枪介导法转化苎麻获得转基因植株的研究［J］.作物杂志，2010(1):87－90.

［26］颜昌敬，黄剑华，陆瑞菊.苎麻花药培养研究初报［J］.上海农业科技，1986(4):17.

［27］刘国民，邓明其，郑思乡，等.苎麻花药和未授粉子房离体培养的研究［J］.作物研究，1994(S1):73 －78.

［28］孙珍夏.苎麻花药培养技术研究［D］.武汉:华中农业大学，2007.

［29］谢卓荣.苎麻多倍体诱导的研究［J］.中国农业科学，1986(2):49－53.

［30］潘昌立，赵立宁，臧巩固，等.苎麻多倍体诱导技术研究［J］.中国麻作，1990(3):11－14.

［31］罗素玉，严文淦，赵立宁，等.苎麻新品种74—69选育研究［J］.中国麻作，1991(4):5－10.

［32］李宗道.兰麻生理生化与遗产育种［M］.北京:农业出版社，1989.

［33］汪剑鸣，孙学兵，刘上信，等.苎麻航天遗传育种研究初报［J］.中国麻作，2005，27(3):113 －114.

［34］潘其辉.苎麻赣苎三号太空诱变SP1代的分离变异［J］.中国麻业科学，2008(3):144 －147.

［35］邢虎成，廖玮玮，揭雨成.我国苎麻育种方法研究进展及面临的问题［J］.作物研究，2010(3):209 －214.