基于CCD的阵列毛细管电泳芯片检测系统研究

杨晓博，闫卫平，杨　飞，窦伟峰

(1．许昌学院电气信息工程学院，河南许昌　461000；2．大连理工大学电子科学与技术学院，辽宁大连　116024)

0　引言

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)芯片是微流控生物芯片的一种，广泛应用于蛋白质组分研究、药物筛选、基因诊断等生化分析领域[1]。阵列CE芯片由于能够同时对多种分析样品进行并行检测，效率更高、成本更低，已成为生化分析领域前沿的研究热点之一[2]。在利用CE芯片进行生化分析的过程中，被测样品的组分及含量等相关信息由检测系统来测定。由于CE芯片中毛细管的内径一般为10～100 μm，样品进样量极少，因而对检测系统的灵敏度、分辨率及响应速度都有较高的要求，检测系统的性能将直接决定CE芯片分析系统的整体性能[3]。

电荷耦合器件(Charge Coupled Device，CCD)是20世纪70年代发展起来的一种新型半导体集成光电器件。它具有噪声低、响应光谱宽、精度和灵敏度高、可靠性好等优点。近几十年来，CCD器件及其应用技术的研究取得了飞速发展，在图像传感和非接触测量领域的发展尤其迅速[4]。针对传统CE芯片荧光检测系统功耗高、体积庞大、噪声难于消除等问题，设计采用CCD作为光电转换器件，搭建出阵列CE芯片荧光检测系统，实现了对多个CE通道荧光信号的同时检测和显示。

1　检测系统组成及其工作原理

基于CCD的阵列CE芯片检测系统结构如图1所示，它主要由绿色LED光源、光路系统、光电转换器件CCD和信号处理系统组成。其工作原理为：绿色LED光源发出的绿光(峰值波长为532 nm)照射至阵列CE芯片分离通道内的荧光染料样品(Rhodamine B)时，样品会在激发光的照射下发出橘红色荧光信号(峰值波长为580 nm)；由于CE芯片采用的是玻璃材料，不可避免的在其表面会产生光的反射和折射现象，发射光与折射光都属于与荧光信号无关的背景噪声，因此需要通过滤光片将其滤除掉；荧光信号经过黑色胶片上的针孔聚焦后传输至光电转换器件CCD，CCD将检测到的荧光信号转换为模拟信号，再通过数据采集卡上集成的高速A/D转换模块，最后经USB总线发送到上位机进行实时显示，根据荧光图谱的峰值即可判断样品的含量。

图1　基于CCD的阵列毛细管电泳芯片检测系统结构示意图

2　CCD芯片及其驱动电路设计

系统中使用的CCD芯片为TCD1304AP芯片。其内部结构如图2所示，主要包括光敏单元(由光电二极管和电荷转移电极组成，含复位脉冲)、移位寄存器(2个)、转移栅电极(2个)、内部驱动信号逻辑电路、输出信号缓冲电路[5]。其中，感光区位于CCD的中央，光敏阵列由光电二极管组成；感光单元中前面32个及后面的14个称为哑元，没有信号输出，用Dn表示；中间的3 648个像素单元是有效的感光单元，用Sn表示。每个光敏单元的大小为8 μm × 200 μm．内部CCD驱动电路由脉冲产生电路和CCD驱动器组成，驱动时钟频率为0.8～4 MHz，时序驱动要求开启电子快门功能的最短光积分时间为10 μs．

图2　TCD1304AP CCD芯片内部结构图

2．1CCD芯片驱动原理

CCD芯片内部感光区两侧分别是2个复位脉冲电极和转移栅电极；最外层是模拟位移寄存器，它由一系列的MOS电容器组成。模拟寄存器负责接收、存储和转移光电二极管产生的电荷包，其中电荷包的转移受控于转移栅电极的作用。

光敏单元在光照作用下获得光生载流子从而形成电荷包，电荷包在转移脉冲信号SH的作用下将会按奇偶序号分开并被转移至两侧的移位寄存器中。电荷包通过奇偶分离的方式后转移速度会得以提高，而当外部驱动电路对ΦM、ICG、SH信号提供合适的脉冲信号时，模拟移位寄存器中的电荷包将由右向左顺次进行转移，这就是外围驱动电路对CCD进行驱动的原理。

为保证检测系统的精确度、测量速度及抗干扰能力，需要解决2个主要问题：为CCD提供正常工作时所需要的时序驱动信号；对CCD输出信号的处理。因此，CCD驱动电路设计包括电源电路设计、时序驱动电路设计及输出信号调整电路设计。此外，还设计了4个光积分时间控制输入端口，用以对CCD芯片光积分时间进行控制。

2．2CCD驱动电源电路

5 V电源电路原理如图3所示，它的工作原理为：1个周期开始时，芯片OUTP引脚被置低，打开与其相连的P沟道场效应管Q2，电流从输入端流经检测电阻、MOS场效应管及电感线圈流到输出端，电流幅度将增大并且受控于电感线圈；落在检测电阻R1上的电压在芯片内部放大，经过内部补偿后稳定在1个区间内，补偿后的信号将与误差放大器的输出进行比较，当此信号与误差电压相等时，P沟道场效应管被截止；电感中的电流将通过二极管D在LC回路中振荡，与此同时，N沟道场效应管被打开，MOS场效应管的电压降小于二极管上的正向电压降，这使得转换器的效率得以提高；在1个周期的最后，N沟道场效应管在控制器的控制下关闭，新的周期循环开始，如此往复，使得电源电路输出持续稳定的电压。

2．3CCD时序驱动电路

CCD驱动模块的逻辑连接如图4所示。其中，CCD驱动模块的输入端有系统时钟输入clkin、复位信号reset、光积分时间调整输入端M1～M4；输出信号端有复位脉冲ICG、帧转移信号SH、CCD驱动时钟Mclk、像元同步信号SP及行同步信号FC.另外，FPGA芯片的所有输入、输出端口均通过TC74HC04芯片与外界相连。该芯片是一种高速的CMOS反相器，其转换速度可以与LSTTL电路相媲美，具有高噪声限和输出稳定的特性，所有的输入端都有电流保护装置。

图4　CCD驱动模块逻辑连接图

2．4CCD输出电压调整电路

CCD输出电压调整电路如图5所示。其中，电容C7～C9为滤波电容，用以滤除电源或输出端的高频干扰；放大器采用AD8031电压反馈式轨对轨放大器，其正向输入端为电压补偿电路，VCC经过R9和R10分压后的电压V+补偿到放大器的正向输入端以提高输出端的电压；反向端构成1个电压负反馈电路，起到放大CCD的OS端输出电压VOS的作用；通过调整可变电阻器R10和R5的值可以使输出电压VO的值满足后续A/D转换芯片的满量程要求，进而提高CCD采集数据的精度和测量范围。

图5　CCD输出电压调整电路

2．5CCD积分时间控制电路

CCD驱动模块有4个输入端(M1～M4)，用来控制CCD的积分时间，其控制信号来自CY7C68013的PC0～PC3端口。当MCU接收到上位机的设置积分时间指令后，先读出配置参数，然后对PC端口的低四位进行配置，经过如图6所示的电路后到达CCD驱动器的M1～M4端口，起到控制积分时间的作用[6]。由图中可以看出，当PCx口置高时，三极管被导通，Mx被置低；反之则被置高，即PCx端口和Mx端口逻辑反相。例如，若要分配积分时间最长，即{M1，M2，M3，M4}为{1，1，1，1}，则将PC0～PC3口全部置零即可。

图6　CCD积分时间控制电路

3　系统软件设计

系统硬件环境的搭建是功能实现的基础，而系统软件的设计则是系统功能实现的具体过程。根据系统的具体功能，软件的设计主要包括两部分：上位机程序，包括PC机端USB设备的驱动及相应的检测控制程序；下位机程序，包括8051增强型单片机固件程序及保证芯片FX2模块工作在Slave FIFO模式下的FPGA实现。

USB驱动程序开发采用Windows Driver Module模式，即Windows驱动程序模式。它的实现过程是在Visual C++ 6．0的编程环境下，利用Driver Studio自带的Driver Wizard产生设备驱动程序框架，进而完成系统所需的USB驱动程序。固件编程即为USB外设所编写的单片机程序，主要完成以下工作：USB芯片内嵌的增强型8051单片机接收并识别出上位机发送的命令，比如开启CCD、设置CCD参数、数据采集等命令，然后执行相应的操作。程序采用C语言开发，使用Keil C进行编译和调试。下位机软件的流程图如图7所示。

图7　下位机软件流程图

软件设计使用FPGA芯片将FX2模块配置为Slave FIFO模式进行数据采集，并通过USB接口传输至上位机。

FPGA程序设计使用Verilog HDL语言实现，在QUARTUS II 9．0平台上完成程序的综合、实现及下载，同时使用ModelSim软件进行仿真。通过对CCD驱动输入信号时序要求的分析可知，CCD的像元同步信号和行同步信号需作为输出信号，以便于对后续A/D转换进行同步。

4　测试结果及分析

4．1CE芯片结构

检测系统中使用的四通道阵列毛细管电泳芯片结构如图8所示。芯片通道单元结构为基本的十字构型，其中进样通道长10 mm，分离通道长40 mm，检测点与十字交叉点处的距离为30 mm，相邻两分离通道间距离为6 mm；通道深60 μm，宽100 μm(深40 μm处)，储液池直径为2 mm，容积约为5 μL；整个芯片尺寸为40 mm × 80 mm．此外，设计的支撑网格起到更有效封接基片和盖片的作用。

图8　四通道阵列毛细管电泳芯片结构示意图

4．2芯片电泳分离操作

每次电泳实验前，依次使用1 mol/L(M)的NaOH溶液、去离子水(18 MΩ)和tris-borate-EDTA (2 × TBE，pH 8.3)缓冲溶液清洗CE芯片微通道。实验过程中采用电动进样模式进行荧光染料Rhodamine B样品的进样。进行电泳操作前，首先取适量Rhodamine B储备液稀释在无水乙醇中配制成一定浓度的样品溶液，接着将缓冲液和样品加入各自的储液池中。进样阶段，样品从S(600 V)迁移至SW，B和BW电极电压分别为400 V和600 V，SW电极悬浮。进样20 s后，高压电源切换，样品带从B(800 V)迁移至BW进行分离并检测。此时，S和SW电极电压均为600 V，BW电极悬浮(S、SW、B、BW见图1)。每次电泳操作结束后，立即用去离子水清洗芯片微通道，以免缓冲溶液水分蒸发引起毛细管通道堵塞。

4．3样品电泳分离结果

为验证设计出的阵列CE芯片荧光检测系统的性能，将CE芯片的4个分离通道中依次注入4种不同浓度的Rhodamine B样品溶液进行电泳分离，其浓度依次为1.0×10-6M，1.0×10-5M，1.0×10-4M，1.0×10-3M．得到的电泳分离谱图如图9所示，由图可以看出，4个荧光信号的峰值由左至右依次增高，它与4个毛细管电泳通道中注入的样品溶液浓度依次增大相对应，浓度越大，峰值越高。

图9　四通道毛细管电泳芯片注入不同浓度样品时的电泳分离谱图

5　结束语

设计出的基于CCD的阵列CE芯片荧光检测系统使用绿色LED光源代替传统的半导体泵浦固体激光器；采用线阵高灵敏度的CCD作为荧光信号检测器件，实现了同一检测视野范围内多个通道的同时检测，系统结构简单、成本低、具有较高的信噪比和灵敏度。

参考文献：

[1]王立鼎，刘军山，于建群．集成毛细管电泳芯片研究进展．大连理工大学学报，2003(4)：385-392．

[2]EMRICH C A，TIAN H，MEDINTZ I L，et al．Microfabricated 384-lane capillary array electrophoresis bioanalyzer for ultrahigh-throughput genetic analysis．Analytical Chemistry，2002，74(19)：5076-5083．

[3]PAEGEL B M，EMRICH C A，WEDEMAYER G J，et al．High throughput DNA sequencing with a microfabricated 96-lane capillary array electrophoresis bioprocessor．PNAS，2002，99(2)：574-579．

[4]胡渝，荣健．CCD的发展现状及展望．仪器仪表学报，2005，26(8)：718-720．

[5]李明伟，黄鸽．一种高速线阵CCD图像数据采集系统．仪器仪表学报，2005，26(8)：716-717．

[6]翟晶晶．基于电子快门自动增益的CCD驱动电路研究．现代电子技术，2010(19)：188-190．