激光扫描共聚焦光谱成像中的出射狭缝控制

苗舒越，张运海，高 飞

(1．中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，江苏省医用光学重点实验室，江苏苏州215163;2．中国科学院长春光学精密机械与物理研究所，吉林长春130033;3．中国科学院大学，北京100049)

1 引言

激光扫描共聚焦显微镜［1］(Laser Scanning Confocal Microscopy)是研究微细结构的有效技术手段和必备的大型科学仪器，在生物和工业检测［2－3］领域得到了广泛应用。光谱成像技术能够实现空间图像和光谱数据的统一［4］，共聚焦显微镜中光谱成像技术的引入［5］，使得共聚焦显微镜在保持高清晰度和层析成像能力的基础上，能够对组织样本中的不同荧光成分进行选择性成像，为开展各种复杂的生物学实验［6－9］奠定了基础。

光谱选择是激光扫描共聚焦光谱成像系统的基础。现有光谱选择的实现方式有多通道探测器与移动狭缝两种。多通道探测器方式使用很多个单元光电倍增管(Photomultiplier Tube)组成阵列式光谱仪，按光谱进行分段观测，以实现特定谱段的选择，蔡司(Zeiss)与尼康(Nikon)的共聚焦显微镜均采用此方式，由于PMT价格较昂贵，因此这种方式的设计制造成本较高;出射狭缝方式则是在光谱带位置处设置一个可移动狭缝，通过改变狭缝的宽度和狭缝相对于光谱带的位置，从而实现特定谱段的选择，该方式荧光选择灵活性好，实现方便，设计制造成本较低。

2 原理及方案

样本发出的激发荧光经棱镜分光后成像于谱面上，谱面处设置有两个可以独立移动的缝片，通过控制两个缝片的相对移动，改变狭缝的宽度和狭缝的位置，从而只允许特定波段的荧光通过，如图1(a)所示。系统中设计了三路这样的光谱选择通道，狭缝1的两缝片表面镀有反射膜，将到达缝片表面的光反射至通道 2、3，狭缝 1、2、3 分别选择 PMT1、PMT2、PMT3上接收的光谱范围，如图1(b)所示。各通道观测整个波段中的一部分，以实现同时对不同波段的荧光进行成像。

图1 基于可移动狭缝的光谱选择原理图

项目组设计的光谱成像系统要求工作波长范围为400～700 nm，最小光谱带宽应优于5 nm，光谱带宽范围5～300 nm可调。通过计算得出，每个狭缝宽度的可调范围为 0．04～6 mm，调节增量为 0．01 mm。

为保证位置精度，缝片由单步移动2．5μm的步进电机驱动，主控单元选用ARM芯片，其同时对三路通道的步进电机进行控制。每个狭缝的控制模块均构成一个独立的伺服控制系统，其中旋转编码器和光耦开关用来实现位置反馈。编码器通过角度检测反馈绝对位置，步进电机根据负反馈进行数次调整，以达到精确定位;光耦开关则在系统启动时精确定位缝片的初始原点位置并实时检测当前处于工作位置的狭缝，控制系统框图如图2所示。

图2 出射狭缝控制系统框图

3 设计与实现

3．1 步进电机控制

步进电机的控制信号需要两路，如图3所示。一个CW脉冲使步进电机正转一个步距角，一个CCW脉冲使步进电机反转一个步距角，其中CW脉冲与CCW脉冲同一时刻只能有一个存在，在步进电机正转脉冲后需要等待一定的时间才能发送反转脉冲，脉冲的频率决定了步进电机转动的速度。

图3 步进电机控制时序

控制脉冲信号由作为主控单元的ARM生成，利用ARM控制器的GPIO输出口，输出两路脉冲信号。在软件上保证两路脉冲信号不能同时存在，脉冲个数以及脉冲频率可设定，控制电路如图4所示。

图4 ARM和电机驱动器连接原理图

3．2 编码器设计

编码器的输出信号为SSI同步串行信号，输出格雷码，SSI实际为两对RS422，一对时钟触发，一对数据发送。SSI的时序如图5所示，时钟信号从ARM控制器发出，以编码器的总位数输出N个中断的脉冲，编码器的绝对位置值由时钟信号触发，从格雷码的高位(MSB)开始，输出与时钟信号同步的串行信号。不传送信号时，时钟和数据位均是高位，在时钟信号的第一个下降沿，当前位置值被储存，从时钟信号上升沿开始，数据信号开始传送，一个时钟脉冲同步一个数据。

图5 SSI时序图

利用ARM的GPIO模拟SSI时序，通过RS422芯片，实现差分时钟信号的产生以及差分数据信号的接收。原理电路如图6所示，RS422芯片选择MAX3488，供电电压3．3 V。MAX3488的单端信号输入口DI连接ARM的GPIO输出口，以接收时钟信号;单端信号输出口RO连接ARM的GPIO输入口，将编码器绝对位置信号传送给ARM控制器。

图6 编码器与ARM连接原理图

3．3 光耦开关设计

光耦开关选用欧姆龙的EE－SX770A，该型号的光电开关在挡光的情况下是工作状态，输出有效低电平;在通光的情况下是非工作状态，输出高电平。通过检测输出口的高低电平可以判断光电开关的工作状态，从而可以检测相关机构的特定位置。检测输出口高低电平的电路如图7所示，利用ARM的GPIO输入口检测高低电平，中间利用光耦器件将光电开关侧的电路与ARM侧的电路隔离开来以避免光电开关侧的高电平电压损坏ARM芯片。

图7 光电开关和ARM连接原理图

4 实验结果

狭缝位置和光谱波长之间的对应关系是实现基于可变移动狭缝光谱扫描技术的基础，因此首先进行狭缝位置标定实验。实验中使用汞灯及激光作为标定光波，有405 nm、435．8 nm、485 nm、546．1 nm、578 nm、638 nm共6种波长，同时接收6种光波，在CCD上观察到6个波长点，计算各波长点在空间上的相对位置，得出的实际位置与理论波长位置存在偏差。如图8所示，以546．1 nm波长点为坐标原点，黑线为理论波长位置，散点为三个通道的实测位置。

图8 波长位置理论值与三通道实测值

使用三次多项式拟合，对波长位置进行修正，得到拟合波长曲线后，转换为电机控制表，进行缝片位置控制实验，实验表明每个缝片对于6个波长点均可准确对心，从而实现了对于缝片位置的精确控制，其中一个缝片的位置控制如图9所示。

通过对两个缝片的位置进行协调控制，本文所设计的狭缝控制系统能够自由精确地控制出射狭缝的位置与宽度。最终进行实际成像实验，实验使用莱卡显微镜自带的样本玻片，其含有三种荧光染料，它们分别由波长为405 nm、488 nm与638 nm的激光激发。控制三个出射狭缝，使三路通道的接收荧光波长范围分别为410～460 nm、540～600 nm以及650～700 nm。实验成像如图10所示，实验表明本文设计的狭缝控制系统能够同时对同一样本中不同波段的荧光成分进行成像。

图9 缝片位置控制实验

图10 三路通道同时成像实验

5 结论

本文设计的激光扫描共聚焦光谱成像狭缝控制系统，通过伺服控制的方式，利用ARM芯片控制步进电机驱动缝片运动，并由编码器和光耦开关提供位置负反馈，可精确设置出射狭缝的中心位置与宽度，从而实现了激发荧光中不同波长成分的选择，其中每个出射狭缝的宽度在0．04～6 mm范围可调，调节增量为0．01 mm，通过ARM主控单元的协调，系统能够同时对三路通道中的狭缝进行控制。缝片位置控制实验结果表明该控制系统能够精确控制缝片的位置，实现了波长选择的功能;实际成像实验结果表明该系统能够同时对同一样本中不同的荧光成分进行成像，提高了对于荧光样品观测的灵活性与观察效果。

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