慢性丙型肝炎患者树突状细胞体外培养后IL-12、INF-γ水平变化

徐 丽，刘积平，吴晓燕，李修范，杨乐清，闫慧梅，崔宪影

慢性丙型肝炎患者树突状细胞体外培养后IL-12、INF-γ水平变化

徐 丽，刘积平，吴晓燕，李修范，杨乐清，闫慧梅，崔宪影

目的探讨慢性丙型肝炎患者树突状细胞(dendritic cells，DC)体外培养后细胞因子IL-12、INF-γ水平变化。方法选择32例慢性丙型肝炎患者作为观察组，30例健康体检者作为对照组，分别取抗凝血50 ml，经过DC体外培养后留取上清液5 ml备检，用ELISA试剂盒检测两组培养前、后细胞因子IL-12、INF-γ的水平变化。结果观察组实验前血清中细胞因子IL-12为(38.46±4.97)ng/L，INF-γ为(15.27±2.67)pg/ml，对照组分别为(61.10±4.38)ng/L、(27.24±1.79)pg/ml ，两组差异有统计学意义(P<0.01)。观察组DC培养后上清液中IL-12为(337.91±13.35)ng/L，INF-γ水平为(6076.72±403.43)pg/ml，对照组分别为(661.44±52.99)ng/L、(10 449.00±626.54)pg/ml ，两组差异有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养后DC分泌IL-12、INF-γ水平明显高于培养前，提示通过DC培养提高细胞因子水平诱导细胞免疫，可作为慢性丙型肝炎的一种新型辅助疗法。

慢性丙型肝炎；树突状细胞；IL-12；INF-γ

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的传染性疾病。近年来许多研究表明，免疫因素，尤其是细胞免疫异常可能是丙型肝炎发病的重要机制，并且细胞因子在其中起着至关重要的作用。抗病毒免疫应答是一个复杂的过程，有许多免疫细胞和免疫因子参与，其中树突状细胞(DC)在机体抗病毒免疫应答中发挥着中心作用，DC为产生IL-12的主要细胞，IL-12是促进Th0向Th1分化的细胞因子，作为诱导机体天然免疫和获得性免疫的核心环节，DC在控制丙型肝炎病毒的感染及清除病毒的过程中起重要作用[1]。近年来，随着生物免疫技术的发展，树突状细胞的体外培养技术也逐渐成熟。因此，本研究观察慢性丙型肝炎患者树突状细胞体外培养前后血清及上清液中细胞因子IL-12、INF-γ水平变化，探讨该变化与丙型肝炎病毒持续感染的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2010-09至2012-06在本院门诊、住院诊断为轻度慢性丙型肝炎患者32例作为观察组，男20例，女12例，年龄18～65岁，丙型肝炎病毒标志物均阳性，103 Copies/ml

1.2 仪器与试剂 CO2细胞培养箱BC-JL60S，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。低速台式大容量离心机TDL-40C，上海安亭科学仪器厂。洁净工作台VS-840-2，上海博迅实业有限公司医疗设备。用ELISA试剂盒检测细胞因子：IL-12、INF-γ试剂购于上海森雄科技有限公司进口分装(按说明书操作)。微量加样枪(上海球精生化试剂有限公司)，高级酶标仪(瑞士 TecanSU NRISE公司)。PCR检测仪器、试剂均由雅培公司提供。丙型肝炎抗体用化学发光法测定，试剂由北京源德生物有限公司提供。

1.3 方法及标本检测 (1)观察组及对照组分别抽取5 ml静脉血，提取血清，冷冻-20℃冰箱中备检。(2)两组分别抽取肝素抗凝的外周静脉血50 ml，用密度梯度离心及粘壁法获得单核细胞。DC的诱导培养方法参照文献[3]进行，并作适当修改：在37 ℃和5%CO2浓度的条件下，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4等细胞因子诱导扩增出DC，使其成为抗HCV-DC。于培养第7天取上清液5 ml，冷冻-20 ℃冰箱中备检。(3)检测两组培养前血清中细胞因子IL-12、INF-γ水平及DC体外培养后上清液IL-12、INF-γ水平。

2 结 果

观察组实验前血清中细胞因子IL-12为(38.46±4.97)ng/L，INF-γ水平为(15.27±2.67)ng/L，对照组分别为(61.10±4.38)ng/L、(27.24±1.79)ng/L，两组差异有统计学意义(P<0.01)。观察组DC培养后上清液中IL-12为(337.91±13.35)ng/L，INF-γ水平为(6076.72±403.43)ng/L，对照组分别为(661.44±52.99)ng/L、(10 449.00±626.54)ng/L，两组差异有统计学意义(P<0.01)。丙型肝炎观察组血清及DC培养后上清液IL-12、IFN-γ水平均明显低于对照组；两组DC体外培养后上清液中IL-12、INF-γ水平均明显高于实验前血清中IL-12、INF-γ的水平。

3 讨 论

DC是目前所知的最强的抗原提呈细胞(APC)，它能够诱导免疫应答并能够维持对自身抗原和非自身抗原的免疫耐受，在启动有效的抗病毒T细胞应答中扮演重要角色。T细胞是产生IFN-γ的主要细胞，DC为产生IL-12的主要细胞。IL-12作为IFN-γ的诱生因子，其水平的下降将引起IFN-γ水平的降低。IL-12、IFN-γ主要参与对APC、巨噬细胞、NK细胞、B细胞的膜分子表达、活化和分化进行免疫调节，协同IL-2诱导NK细胞增殖及LAK细胞产生，促进同种异体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic tlymphocyte,CTL)的反应[4]。机体不能诱导强大的、有针对性的CTL反应可能与HCV-DC功能缺陷，产生IL-12和IFN-γ的能力受损有关[5]。总之，DC的功能状态在HCV患者机体抗病毒免疫应答中发挥着中心作用[6]。

本实验结果显示，丙型肝炎观察组血清及DC培养后上清液IL-12、IFN-γ水平均明显低于对照组；两组DC体外培养后上清液中IL-12、INF-γ水平均明显高于实验前血清中IL-12、INF-γ的水平，差异均有统计学意义(P<0.01)。本实验结果显示，由于慢性丙型肝炎患者的DC功能低下，导致其血清及DC体外培养后IL-12、INF-γ的水平均明显低于健康人。DC功能低下导致的免疫功能下降，是HCV患者抗HCV免疫应答水平较低的原因之一，可能与丙型肝炎慢性持续感染相关，这为生物免疫疗法用于慢性丙型肝炎的治疗提供了科学依据。

观察组与对照组DC体外培养后上清液中IL-12、INF-γ水平均明显高于实验前水平，说明此种体外培养方法可以提高慢性丙型肝炎患者DC的功能状态，从而提高了IL-12、INF-γ的水平。通过检测DC体外培养后上清液中IL-12、INF-γ的水平，了解HCV感染者体内DC的功能状态，能够为揭示DC与慢性丙型肝炎患者HCV持续感染的关系提供实验依据。

总之，慢性丙型肝炎患者能否通过DC体外培养回输，提高DC功能，诱导细胞免疫，提高抗病毒的能力，是目前生物免疫治疗亟待解决的问题。本研究尚属体外实验，由于例数较少，观察时间较短，还有待于进一步研究予以证实。

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(2013-06-09收稿 2013-08-12修回)

(责任编辑 尤伟杰)

ChangesinlevelsofIL-12andINF-γaftercultureinvitroofdendriticcellsofpatientswithchronichepatitisC

XU Li, LIU Jiping, WU Xiaoyan, LI Xiufan, YANG Leqing, YAN Huimei, and CUI Xianying.
Department of Lemology, Jilin Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Changchun 130052, China

ObjectiveTo study the changes in levels of cytokines IL-12 and INF-gamma in patients with chronic hepatitis C after cultureinvitroof dendritic cell (DC).MethodsThirty-two patients with chronic hepatitis C were recruited as the observation group, and 30 healthy subjects undergoing physical examination as the control group, 50 ml of anticlotting blood was taken separately. After culture of DCinvitro, 5 ml of supernatant fluid were returned for examination. Using ELISA kit, the cytokines IL-12, INF-gamma level changes before and after culture in the two groups were examined.ResultsIn the observation group, before the experiment, serum cytokine IL-12 was (38.46±4.97) ng/L and IFN - gamma was (15.27±2.67) pg/ml; in the control group, the cytokines were (61.10±4.38) ng/L and (27.24±27.24) pg/ml, respectively; the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01). In the observation group, after culture of DC, IL-12 in the supernatant fluid was (337.91±13.35) ng/L, IFN-gamma was (6076.72±403.43) pg/ml; in the control group, the cytokines were (661.44±52.99) ng/L and (10 449.00±626.54) pg/ml, respectively; the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01).ConclusionsAfterinvitroculture of DC, secretion of IL-12, and the INF-gamma is obviously higher than that before culture, suggesting that raising the level of cytokines induced by DC immune cells can be used as a new auxiliary therapy in the treatment of chronic hepatitis C.

chronic hepatitis C; dendritic cells; IL-12; INF-gamma

徐 丽，本科学历，主任医师，E-mail：ylq1027@163.com

130052长春，武警吉林总队医院传染科

R512.63