毕赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化合成APG的工艺条件优化

胡霞艳 刘端玉 郑穗平

（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）

毕赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化合成APG的工艺条件优化

胡霞艳 刘端玉 郑穗平

（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）

使用毕赤酵母细胞表面展示棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶作为全细胞催化剂，以葡萄糖为底物，在水-醇双相体系中逆水解合成C6-C10烷基糖苷。讨论了含水量、葡萄糖添加量、全细胞催化剂添加量、乙酸-乙酸钠缓冲液pH值和温度等主要因素对反应的影响，并与商品酶苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188进行比较。结果表明，Novozym188不适合逆水解合成APG，苦杏仁β-葡萄糖苷酶反应所需时间短，但最终转化率不如全细胞催化剂。在 5 mL反应体系中，合成HG的最优条件：葡萄糖0.1 g，全细胞催化剂0.05 g，10% pH 3.0 buffer；合成OG的最优条件：葡萄糖0.2 g，全细胞催化剂0.05 g，15% pH3.0 buffer；合成DG的最优条件：葡萄糖0.2 g，全细胞催化剂0.2 g，20% pH 3.0 buffer；放置55℃ 200 r/min 恒温振荡器中，反应时间为72 h，HG和DG的最大产率分别为11.69%和3.58%，而OG的产率则在96 h到达最大值6.34%。

细胞表面展示 β-葡萄糖苷酶 全细胞催化剂 烷基糖苷

烷基糖苷（Alkyl polyglycoside，APG）是生物降解迅速且彻底，无毒低刺激的“绿色”表面活性剂。它不仅具有表面张力低，泡沫丰富而稳定，去污性优良，而且配伍性能极佳，可广泛于洗涤剂、化妆品、农药、纺织等行业，是下一代新型表面活性剂最有希望的品种之一［1］。化学合成法是合成APG的传统方法，但是由于化学法需要选择性保护基团，激活和耦合等步骤，不仅耗时长，还不可避免地存在副反应。过去的十多年中利用酶法合成糖苷和低聚糖成为研究热点，因为酶法合成APG具有很多化

学法不可比拟的优点，例如，不需要保护-去保护过程，具有较好的区域选择性和立体专一性，可以避免异头物的产，反应条件温和产物杂质少且易于纯化。在水-醇双相体系中，酶促逆水解反应合成糖苷只需一步，因此可以大大节省后续的产物提取成本，因而受到人们的广泛关注［2，3］。

棘孢曲霉生产的β-葡萄糖苷酶，既可以水解可溶性纤维寡糖，也可以水解不溶性纤维寡糖［4］。一直以来相关研究报道都是围绕纤维素水解，用于合成APG的研究仍处于探索阶段。近些年，酵母表面展示技术得到了迅速的发展［5］，其中巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）作为一种新型的真核表达系统，具有表达量高分泌能力强，生长快和操作简便等特点，还具有真核细胞翻译后的加工和修饰功能，适合表达需翻译后修饰的外源蛋白。它能将外源A-BGL以融合蛋白的形式展示在细胞的表面，保持A-BGL原有的生物活性和相对独立的空间构象，因此展示有A-BGL的酵母细胞可以作为全细胞催化剂表现出耐温、耐有机溶剂和热稳定性好等优良特性。韦斌如等［6］在毕赤酵母细胞表面成功展示了A-BGL，并初步用于催化合成APG。

本研究利用棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶重组毕赤酵母菌株GS115/pKFS-ABGL作为全细胞催化剂，在水-醇双相体系中逆水解合成APG，并探讨含水量、葡萄糖添加量、全细胞催化剂添加量、乙酸-乙酸钠缓冲液pH值和温度等主要因素对反应的影响，并根据对影响大小确定主次影响因素，为后续工艺优化试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶重组毕赤酵母菌株GS115/pKFS-ABGL由本实验室构建和保存，Novozym 188购于诺维信，游离苦杏仁β-glucosidase购自Sigma。对硝基苯基β-D-葡萄糖苷（pNPG）、己基β-D-葡萄糖苷（HG）、辛基β-D-葡萄糖苷（OG）、癸基β-D-葡萄糖苷（DG）、购自Sigma公司；其它试剂均为市售试剂。

1.2 方法

1.2.1 毕赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化剂的制备 棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶重组毕赤酵母菌株GS115/pKFS-ABGL培养于 YPD 琼脂固体平板上，培养24 h后接种至YPD液体培养基中，30℃，250 r/min 培养 24 h，以1%的接种量转接到新鲜BMGY 培养基中，30℃，250 r/min 24 h，然后在4℃、8 000 r/min 离心10 min 得到菌体，转入 BMMY培养基中，30℃，250 r/min 培养 5 d，每隔 24 h 加入0.5%（V/V）甲醇诱导。然后收集发酵菌体，离心，用双蒸水洗两次，最后用少量双蒸水重悬，通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。培养基均按 Invitrogen 公司毕赤酵母表达操作手册配方配制。

我们首先从GPS数据中去除事件前的偏移。然后我们假设加速度仪每个分量的基线误差是时间的函数，并一般可用线性函数结合正弦函数表示：

1.2.2 GS115/pKFS-ABGL冻干酶粉逆水解合成APG在水-有机构成的5 mL体系中以葡萄糖为底物逆水解合成APG，分别探讨了含水量、葡萄糖添加量、全细胞催化剂添加量、乙酸-乙酸钠缓冲液pH值和温度等主要因素对反应的影响，并优化反应条件。最后在相同的反应条件下，比较实验室自制的全细胞催化剂GS115/pKFS-ABGL冻干酶粉和商品酶苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188合成HG、OG和DG的催化效率。

1.2.3 GS115/pKFS-ABGL冻干酶粉合成APG的操作稳定性 全细胞催化剂的预处理：取全细胞催化剂于丙酮中，置于恒温摇床中55℃，200 r/min，放置24 h。离心除去有机溶剂丙酮，收集酶粉，于30℃恒温箱中放置24 h。然后取全细胞催化剂用于催化合成HG、OG和DG。反应72 h后的反应液，离心去掉上清，酶粉用丙酮洗两次，收集得到全细胞催化剂，置于30℃恒温箱中放置24 h，重复用于催化合成HG、OG和DG，如此重复使用5次。

1.2.4 HPLC-ELSD定量分析 APG APG的检测采用Waters 2695型高效液相色谱仪。色谱条件：色谱柱Zorbax SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm i.d），流速1 mL/min，柱温30℃，2424 型ELSD 检测器，进样量10 μL，漂移管温度55℃，氮气流速30 psi。以APG的标准品，制作校正曲线，并根据保留时间定性。HG和OG检测均用流动相甲醇∶水=80∶20，葡萄糖、HG和OG的保留时间分别为3.46 min，4.80 min，6.08 min。DG检测用流动相甲醇∶乙酸乙酯∶水=48∶39∶13，葡萄糖和DG的保留时间分别为3.04 min 和3.98 min。

APG的产率=Mg/Me ×100%

式中，Me：反应体系中APG的质量，Mg：反应体系中葡萄糖的质量。

2 结果

2.1 含水量对全细胞催化剂合成APG的影响

图1 含水量对全细胞催化剂合成APG的影响

2.2 葡萄糖和全细胞催化剂添加量对全细胞催化剂合成APG的影响

如图2所示，APG的转化率随葡萄糖添加量的变化有相同的趋势，先升后降。HG最佳的添加葡萄糖量为0.1 g，继续增加葡萄糖量，转化率略会降低。中长链的OG和DG的合成需要更多的底物作为驱动力，最佳葡萄糖添加量比HG的高，添加0.2-0.3g葡萄糖，转化率相似，为了节约成本，均可取最优葡萄糖添加量为0.2 g。总体来说，因为APG含量并没有随着葡萄糖添加量增加而发生变化，所以产率会下降。

优化酶量对于减少反应时间以及过程中的成本是非常重要的。从图3中可以看出，随着酶浓度的增加，APG的产率提高。当全细胞催化剂用量大于0.05 g，再增加全细胞催化剂用量HG和OG产率变化较小。而当全细胞催化剂用量超过0.1 g 时，HG却有一定量的下降。原因可能是过多的酶粉会使传质阻力增大［17］。而对于合成DG而言，在全细胞催化剂添加量低于0.075 g 时，几乎不能检测到DG。而在全细胞催化剂添加量由0.075 g 增加到0.2 g 时，产率增加显著。此后体系中全细胞催化剂添加量继续增加，催化剂很难维持均匀悬浮状态，存在传质阻力，而且酶浓度过高也会导致产物的水解加剧。所以在该反应中0.2 g 是比较合适的全细胞催化剂添加量。

图2 葡萄糖添加量对全细胞催化剂合成APG的影响

图3 全细胞催化剂添加量对APG合成的影响

2.3 乙酸-乙酸钠缓冲液pH值对A-BGL合成APG的影响

如图4所示，反应体系的pH值对反应体系APG产率影响较大，当乙酸-乙酸钠缓冲液pH 值为3时，A-BGL催化合成APG的产率最高。当以水杨苷为底物时，A-BGL的最适pH为4.0-4.5。但从本试验所得结果看，A-BGL通过展示毕赤酵母表面在其对酸度适应性比较强，可适应的pH值范围较广。

2.4 温度对A-BGL合成APG的影响

图4 乙酸-乙酸钠缓冲液pH值对合成APG的影响

从图5中可以看出，温度对反应体系的APG产率有较大的影响，随着温度的变化APG产率会有着明显的变化规律；从30℃到50℃的温度区间内APG产率随着温度的增加而增大，50℃时HG产率达到最大值11.84%。但是随着反应温度到达60℃时其产物浓度和产率却降低了，可能是棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶在高温下变性而失活，酶促反应速度下降。同时温度对反应影响也依赖于介质成分，在合成OG和DG时，反应温度从50℃上升到55℃，其产率增加趋势均相对较大，55℃为其最佳反应温度。

图5 温度对A-BGL合成APG的影响

2.5 全细胞催化剂、游离苦杏仁β-葡萄糖苷酶和Novozyme 188催化合成APG的比较

从图6中可以看出在等酶活的条件下，全细胞催化剂与商品化苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188在合成APG效率上比较。由于Novozym188属于纤维素二糖酶，不适合于逆水解反应，催化合成APG效果较差，尤其是对于长链脂肪醇而言。由于苦杏仁β-葡萄糖苷酶是游离酶，全细胞催化剂比酶活小，单位重量酵母细胞表面展示的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶蛋白较苦杏仁β-葡萄糖苷酶要少。体系处于等酶活的条件，加入酶量较少，杏仁β-葡萄糖苷酶能较好分散在水中，混合均匀，传质阻力相对较小。所以在催化合成APG时，6 h 时产率就到达最大值，之后变化不大。相比之下，全细胞催化剂都所需的反应时间要长一些，但最终的产率全细胞催化剂要略高于商品化苦杏仁β-葡萄糖苷酶。由此可以通过提高展示系统蛋白表达量，进行毕赤酵母的高密度发酵，提高单位干重细胞酶活，可以进一步提高其催化合成APG的效率。

图6 OG合成的反应曲线

2.6 全细胞催化剂合成APG的操作稳定性

酶的操作稳定性是全细胞催化剂的重要特性之一，它直接影响着连续化、自动化生产过程和生产成本。如图7，全细胞催化剂有较好的操作稳定性。在反应5批次后，APG的相对产率变化不大略有下降，其中反应2批次均逐步增加。

图7 全细胞催化剂合成APG的操作稳定性

3 讨论

反应体系中含水量对APG的逆水解合成有较大的影响，Ito等［7］也报道在酿酒酵母细胞表面展示的A-BGL催化以pNPG为底物转糖苷合成APG时，当含水量为5%时，几乎不能合成HG，其最佳含水

量为20%。因为水不仅对维持酶的构象起着重要作用，而且作为溶剂能溶解底物葡萄糖，但是过多的水便会阻碍反应向生成APG的方向进行，导致APG产率下降，所以对反应平衡影响很大，APG的最终产率是由两个反应之间的比例决定的［8］。

理论上底物葡萄糖的提高应有利于反应向合成方向的推动，从而提高APG的产物浓度，但事实证明，增加葡萄糖浓度反而会使产物浓度略有下降，产率显著下降［9］。APG浓度降低主要是因为葡萄糖的浓度过高会对β-葡萄糖苷酶的活性起到抑制作用。在已被研究的β-葡萄糖苷酶中，绝大多数β-葡萄糖苷酶被葡萄糖强烈抑制［10-12］，而且在极低浓度的葡萄糖就能抑制β-葡萄糖苷酶活性［13］。通常葡萄糖对β-葡萄糖苷酶活力的抑制常数Ki为0.2-100 mmol/L［14，15］，也有极少数来自酵母和真菌的β-葡萄糖苷酶，其对葡萄糖的抑制常数超过200 mmol/L［16，17］。Vulfson等［18］报道了在1-己醇为20 mL，添加的葡萄糖为1 mmol（0.18 g）时产率最大。

温度是酶促反应又一个重要因素之一，因为温度不仅影响底物的溶解度，也影响酶活。Ito等报道了棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶转糖苷催化HG时，50℃的产率明显高于30℃的。这是由于提高反应温度可以提高底物葡萄糖的溶解度，降低脂肪醇介质黏度，增加双相反应体系中各相的相容性，使合成反应容易进行。本试验合成APG的最适温度为55℃，这与周亚军［19］报道的固定酶催化合成OG的反应中，温度对葡萄糖转化率的影响相一致。

展示在毕赤酵母表面的A-BGL类似于固定化酶，相比游离酶耐酸性更强，操作稳定性强，可回收利用。本研究全细胞催化剂重复利用了5次，转化率几乎不变，这与任昌琼［20］报道在有机溶剂中用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B合成果糖酯的操作稳定性的结果相似。脂肪醇和乙酸-乙酸钠缓冲液可能有助于酶表面形成一层结构水膜，对酶有一定的保护作用，从而增加其热稳定性。由此可知全细胞催化剂具有良好的水-醇双相体系稳定性和重复利用性，为进一步扩大化生产奠定了良好的基础。

4 结论

本研究通过试验探讨了几种主要单因素对全细胞催化剂GS115/pKFS-ABGL在水-醇双相体系中逆水解催化合成APG产率的影响，并进行优化。合成不同碳链的APG最适条件有所不一样，但总体变化趋势相同。在0-24 h 内，全细胞催化剂催化合成APG的合成速率较低，随着APG合成速率迅速增加，72 h后达到最大产率，其中HG和DG的产率分别为11.69%和3.58%，而OG产率在96 h 才到达最大值6.34%。虽然苦杏仁β-葡萄糖苷酶催化合成APG较好的转化率，但是成本较高。

采用毕赤酵母展示的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶能极大降低酶的应用成本，该酶具有与苦杏仁酶相当甚至略高的转化率。此外，毕赤酵母展示的全细胞催化剂GS115/pKFS-ABGL有较好的操作稳定性，在反应5批次后，APG的相对产率变化不大，可以为酶工业化生产APG大大节省了生产成本，具备较好的应用前景。

［1］ Putnik CF, Borys NF. Alkyl polyglycosides［J］. Soap Chem Spec, 1986, 62：34-37.

［2］ Milosavić NB, Prodanović RM, Jankov RM. A simple and efficient one-step, regioselective, enzymatic glucosylation of arbutin by α-glucosidase［J］. Tetrahedron Letters, 2007, 48（40）：7222-7224.

［3］ Perugino G, Trincone A, Rossi M, et al. Oligosaccharide synthesis by glycosynthases［J］. Trends in Biotechnology, 2004, 22（1）：31-37.

［4］ 杜娟, 庄蕾, 季明杰, 等. 棘孢曲霉SM-L22 β-葡萄糖苷酶的纯化与性质［J］. 菌物系统, 2002, 21（2）：239-245.

［5］ Kondo A, Ueda M. Yeast cell-surface display—applications of molecular display［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64（1）：28-40.

［6］ 韦斌如, 刘端玉, 郑穗平, 等. 棘孢曲霉 β-D-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及烷基糖苷的催化合成［J］.高等学校化学学报, 2012, 33（7）：1498-1504.

［7］ Ito J, Ebe T, Shibasaki S, et al. Production of alkyl glucoside from cellooligosaccharides using yeast strains displayingAspergillus aculeatusβ-glucosidase 1［J］. J Mol Catal B：Enzym, 2007, 49（1）：92-97.

［8］ Rather MY, Mishra S, Chand S. β-glucosidase catalyzed synthesis of

octyl-β-D-glucopyranoside using whole cells ofPichia etchellsiiin micro aqueous media［J］. J Biotechnol, 2010, 150（4）：490-496.

［9］ Ismail A, Soultani S, Ghoul M. Optimization of the enzymatic synthesis of butyl glucoside using response surface methodology［J］. Biotechnol Prog, 1998, 14（6）：874-878.

［10］ Bothast RJ, Saha BC. Ethanol production from agricultural biomass substrates［J］. Adv Appl Microbiol, 1997, 44：261-286.

［11］ Gueguen Y, Chemardin P, Arnaud A, et al. Purification and characterization of an intracellular β-glucosidase fromBotrytis cinerea［J］. Enzyme Microb Technol, 1995, 17（10）：900-906.

［12］ Woodward J, Wiseman A. Fungal and other β-D-glucosidases—their properties and applications［J］. Enzyme Microb Technol, 1982, 4（2）：73-79.

［13］ Saha BC, Bothast RJ. Production, purification, and characterization of a highly glucose-tolerant novel β-glucosidase fromCandida peltata［J］. Appl Environ Microbiol, 1996, 62（9）：3165-3170.

［14］ Karnchanatat A, Petsom A, Sangvanich P, et al. Purification and biochemical characterization of an extracellular β-glucosidase from the wood—decaying fungusDaldinia eschscholziiRehm［J］. Microbiol. Lett., 2007, 270（1）：162-170.

［15］ Mamma D, Hatzinikolaou DG, Christakopoulos P. Biochemical and catalytic properties of two intracellular β-glucosidase from the fungusPenicillium decumbensactive on flavonoid glucosides［J］. J Mol Catal B：Enzym, 2004, 27（4）：183-190.

［16］ Bronnenmeier K, Staudenbauer WL. Purification and properties of an extracellular β-glucosidase from the cellulolytic thermophileClostridium stercorarium［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 1988, 28（4-5）：380-386.

［17］ Xu Y, Wang D, Mu XQ, et al. Biosynthesis of ethyl estersof shortchain fatty acids using whole-cell lipase fromRhizopus chinesisCCTCC M201021 in non-aqueous phase［J］. J Mol Catal B：Enzym, 2002, 18（1）：29-37.

［18］ Vulfson EN, Patel R, Beecher JE, et al. Alkyl-β-glucoside synthesis in a water-organic two-phase system［J］. Biotechnol Lett, 1990, 12（6）：397-402.

［19］ 周亚军, 赖雪雷, 刘艳菊, 等. 固定酶催化合成正辛基葡萄糖苷工艺研究［J］. 现代化工, 2010, 30（2）：163-165.

［20］ 任昌琼. 表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母全细胞催化合成糖酯［D］. 广州：华南理工大学, 2010.

（责任编辑 李楠）

Optimization of the Synthesis of Alkyl Glucoside Catalyzed by Aspergillus aculeatus β-glucosidase-displaying Pichia pastoris Whole-cells

Hu Xiayan Liu Duanyu Zheng Suiping
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）

Aspergillus aculeatus β-glucosidase displayed Pichia pastoris cell surface was used as whole-cell biocatalyst, glucose as substrate, catalyzed synthesis alkyl glucosides of C6-C10 with reverse hydrolysis in water-alcohol two-phase system. The effects of various reaction factors, including water content, whole-cell biocatalyst dose, glucose concentration, pH and temperature were optimized. The catalytic effect of whole-cell biocatalyst were compared with commercial enzyme almond β-glucosidase and Novozym188 . The results showed that Novozym188 was not suitable for synthesis of APG, almond β-glucosidase need shorter time than whole-cell biocatalyst, but the final conversion of whole-cell biocatalyst was higher. In 5 mL total reaction volume, the optimal reaction conditions of HG：0.1 g glucose, 0.05 g whole-cells biocatalyst, 10% pH3.0 buffer；the optimal reaction conditions of OG：0.2 g glucose, 0.05 g whole-cells biocatalyst, 15% pH3.0 buffer；the optimal reaction conditions of DG：0.2 g glucose, 0.2 g whole-cells biocatalyst, 20% pH3.0 buffer, temperature 55℃, 200 r/min. After 72 h the maximum HG and DG yield could be 11.69% and 3.58%. The highest yield of OG was 6.34% after 96 h.

Cell surface displaying β-glucosidase Whole-cell biocatalyst Alkyl glucosides

2013-12-09

国家自然科学基金项目（31171633），广东省工业科技攻关项目（2010B011000004）

胡霞艳，女，硕士，研究方向：酶与酶应用；E-mail：lucksnail@163.com

郑穗平，男，博士，教授，研究方向：酶工程；E-mail：spzheng@scut.edu.cn