川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

胡亮，字向东，卢建远，马力，熊显荣，王永，任称罗尔日, 任陶

（1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041; 2. 四川省理县畜牧局, 四川 理县 623100）

川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

胡亮1，字向东1，卢建远1，马力1，熊显荣1，王永1，任称罗尔日2, 任陶2

（1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041; 2. 四川省理县畜牧局, 四川 理县 623100）

根据GenBank中绵羊的PRLR基因序列设计引物, 以川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊垂体总RNA为模板, 通过RT-PCR技术对川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及进行序列分析, 以期为进一步研究该基因与山羊的繁殖性能奠定理论基础. 结果表明：川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区均长1746bp, 均编码581个氨基酸. 川中黑山羊(金堂类群)PRLR基因编码区与藏山羊、绵羊、牛、牦牛野猪和人的同源性分别为99.71%、99%、95%、95%、83%和80%. 以核苷酸序列构建分子系统进化树, 川中黑山羊(金堂类群)先与藏山羊聚为一类, 再与绵羊聚为一类, 后与牛和牦牛聚为一类, 然后与野猪聚为一类, 最后与人聚为一类.

川中黑山羊(金堂类群); 藏山羊;PRLR基因; 克隆; 序列分析

催乳素又称促乳素或生乳素, 由垂体前叶细胞合成和分泌, 是繁殖成功所必需的激素[1]. 催乳素在动物生长与发育、繁殖与泌乳、内分泌与代谢、电解质平衡等对多种生理过程中起作用[2-3]. 催乳素必须与催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)结合才能发挥其功能, 通过受体作用于靶细胞, 从而引起靶细胞的各种生理生化反应[4].PRLR基因在动物体内分布极为广泛, 在哺乳动物乳腺、卵巢、黄体、前列腺、肝脏等多种组织中均有表达[5-7].PRLR基因作为产仔数性状的一个重要的后选基因被广泛研究[8].

山羊的繁殖性状遗传力低, 筛选和鉴定控制多羔性状基因, 应用分子育种等新技术快速提高其产羔率, 对快速提高我国山羊生产水平和促进羊业的发展具有重要意义. 川中黑山羊(金堂类群)是四川省金堂县长期自然选育和人工培育形成的地方山羊品种, 具有早熟、生长发育快、体型大、繁殖力强、生存适应范围广等优良特性[9-10]. 藏山羊广泛分布在西藏、四川、青海和甘肃等广大牧区、半农半牧区和农区, 其繁殖率低, 绝大多数一年产1羔[11]. 因此, 本研究以川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊为研究对象, 对其PRLR基因进行克隆及序列比对分析, 为山羊PRLR基因的定位、表达调控以及与繁殖性能的关系等研究提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验动物

分别选取四川省金堂县和理县川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊, 屠宰后立即采集垂体, 迅速放入液氮中备用.

1.2 主要试剂

TRIzol®Reagent购自Life Technologies公司; 2×Long PCR MasterMix感受态细胞均购自上海天根生物科技有限公司; DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物工程有限公司; 反转录试剂盒购自FERMENTAS (MBI )公司; 克隆载体pMD-19 Vector、氨苄青霉素(Ampr)购自大连宝生物公司.

1.3 PCR引物设计及合成

根据GenBank中绵羊PRLR基因序列(登录号：AF041257.1)设计一对引物, 上游：5'-AGAGGAAGGAGCCAACATGAAG -3'、下游: 5'-GCTGGATTCTATGGCAGGG -3', 由上海英俊生物技术有限公司合成.

1.4 总RNA的提取及cDNA的合成

用Trizol法提取藏山羊和川中黑山羊(金堂类群)垂体中的总RNA后, 根据Fermentas反转录试剂盒进行cDNA的合成.

1.5 PRLR基因的PCR扩增、纯化

以反转录cDNA作为模板进行PCR反应, 反应体系为25μL：上、下游引物(20pmol/L)各1μL, cDNA模板0.5μL, 2×Taq PCR MasterMix12.5μL, ddH2OμL. PCR反应条件：95℃预变性4min; 94℃变性30s, 54℃退火35s, 72℃延伸90s, 30个循环; 最后72℃延伸4 min; 4 ℃保存. PCR产物纯化按照爱思进生物工程有限公司胶回收试剂盒进行.

1.6 PRLR基因的克隆、鉴定和测序

胶回收产物与克隆载体pMD-19Vector于16℃连接过夜. 连接反应产物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的LB固体平板上, 于37℃恒温箱培养过夜. 挑选白色单克隆菌落于LB液体培养基37℃振荡培养12 h, 并进行菌液PCR鉴定, 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后, 挑选阳性克隆菌液2mL送交上海英俊生物技术有限公司测序.

2 结果

2.1 PRLR基因PCR扩增结果

分别吸取5uL川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因扩增产物对其进行电泳检测, 用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测条带, 如图1, 川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因目的条带, 与预期大小1770bp基本一致,且目的条带明亮, 有利于后续实验的进行.

图1 川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因琼脂糖电泳Fig.1 Electrophoresis results of Chuanzhong black goat and Tibetan goat PRLR genes PCR products

2.2 川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因序列测定

获得的川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区的核苷酸序列已提交到NCBI中(川中黑山羊的登录号：KJ792312, 藏山羊的登录号：KJ782313),PRLR基因的编码区均长1746bp, 均编码581个氨基酸, 理论分子质量分别为65261.49、65305.61. 川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区序列比对, 同源性为99.71%, 有5处碱基不同：177位T→C, 786位C→T, 797位T→C, 1355位C→T, 1645位G→A. 核苷酸的不同引起2处氨基酸的差异(图2)：452位I(异亮氨酸)→T(苏氨酸)、549位M(甲硫氨酸)→V(缬氨酸).

图2 川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区氨基酸序列比较Fig.2 Comparison of animoacids of PRLR gene in Chuanzhong black goat and Tibetan goat

2.3 PRLR基因编码区的同源性比对与分子进化树的构建

经过比对发现, 川中黑山羊(金堂类群)PRLR基因与藏山羊、绵羊、牛、牦牛、野猪、人的同源性分别为99.71%、99%、95%、95%、83%和80%, 说明PRLR基因有较高的保守性. 用Mega5.0 等生物软件构建分子系统进化树, 如图3, 结果表明, 川中黑山羊(金堂类群)与藏山羊的亲缘关系最近. 川中黑山羊(金堂类群)先与藏山羊聚为一类, 再与绵羊聚为一类, 后与牛和牦牛聚为一类, 然后与野猪聚为一类, 最后与人聚为一类, 符合进化关系.

图3 基于核苷酸序列的PRLR基因的系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of PRLR gene in mammals

3 讨论

很多研究表明PRLR基因与动物繁殖性状相关, 还影响动物初情期年龄、排卵数、生殖器官的大小、卵巢重量和子宫等[4]. Vincent等[12]1998年发现,PRLR基因与产子数相关. Terman[13]研究波兰猪PRLR基因与产仔数的关系的表明, 不同的PRLR基因型的第一胎母猪之间产仔数的差异显著(p<0.01). 穆晓琨等[14]对乐至黑山羊PRLR基因第10外显子进行了PCR-SSCP检测与产仔性能的相关性研究, 结果表明PRLR基因对乐至黑山羊的产仔性能有一定影响.

本研究通过RT-PCR技术克隆得到川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因序列, 均长1770bp, 其中编码区序列长1746bp, 二者编码区序列存在5处碱基的差异, 导致2处氨基酸的不同, 这种差异是否直接影响了川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊产羔数还有待进一步研究.PRLR基因编码区与其他物种同源性较高, 说明PRLR基因具有较高的保守性. 构建的分子系统进化树表明, 川中黑山羊(金堂类群)先与藏山羊聚为一类, 再与绵羊聚为一类, 后与牛和牦牛聚为一类, 然后与野猪聚为一类, 最后与人聚为一类. 川中黑山羊(金堂类群)与藏山羊的亲缘关系最近, 符合进化关系. 系统进化树各个分支臵信度高, 结果可靠.

多胎的川中黑山羊(金堂类群)和单胎的藏山羊PRLR基因的克隆和序列比对分析, 为进一步研究PRLR基因对山羊产羔率的影响提供了一定的理论依据, 为提高山羊繁殖率奠定了理论基础.

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Cloning and sequence analysis of PRLR gene in Jintang black goat and Tibetan goat

HU Liang1, ZI Xiang-dong1, LU Jian-yuan1, MA Li1, XIONG Xian-rong1, WANG Yong1, RENCHEN Le-er-ri2, REN Tao2
(1. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Animal Husbandry Bureau of Lixian County, Sichuan 623100, P.R.C.)

The primers were designed according to the GenBank gene sequence of sheepPRLR. Total RNA was extracted from the pituitary of Jintang black goat and Tibetan goat. ThePRLRgene of Jintang black goat and Tibetan goat were cloned and the sequences were analyzed in order to understand the effect of this gene on reproductive performance in goat. The results showed that the amplification coding region of thePRLRgene in Jintang black and Tibetan goat was 1746bp long, encoding 518 amino acids. The homologies of CDS ofPRLRgene between Jintang black goat and Tibetan goat, sheep, cattle, yak, pig and human were 99.71%, 99%, 95%, 95%,83% and 80%. Phylograms constructed on the basis of CDS from species indicated that Jintang black goat and Tibetan goat, then assembled with sheep, cattle sand yak assembled separately, and then assembled with pig, and then assembled with human finally.

Jintang black goat; Tibetan goat;PRLRgene; clone; sequence analysis

S814,S827

A

1003-4271(2014)04-0485-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.02

2014-06-09

字向东(1963-), 男, 白族, 云南云龙人, 教授，E-mail: zixd@sina.com.

四川省应用基础项目（2013JY0043）.