乳腺癌干细胞的研究现况*

苏盈盈王伏生

乳腺癌干细胞的研究现况*

苏盈盈①王伏生①

乳腺癌是当今严重危害女性健康及生命的头号杀手，目前有多项研究认为乳腺癌起源于乳腺癌干细胞。乳腺癌干细胞理论的提出较为合理地解释了乳腺癌的根源、复发及转移等生物学行为，为根治乳腺癌提供了一个新的方向。

乳腺癌； 乳腺癌干细胞； 信号通路； 治疗

乳腺癌是当今严重危害女性健康及生命的头号杀手，已成为当代女性肿瘤性疾病中发病率最高的肿瘤[1]。尽管医疗水平和诊疗技术不断进步提高，但主要还是以手术切除癌灶，结合化疗、放疗以及生物治疗，仍然有很多患者出现化疗耐药、复发和转移，最终导致治疗失败。乳腺癌干细胞理论学说的提出，让无数学者看到了乳腺癌彻底根治的希望。乳腺癌干细胞是一类存在于乳腺癌组织中数量很少，具有自我更新能力和产生异质性肿瘤细胞的细胞亚群，与乳腺癌的起源、转移和复发等有着极为密切的关系。

1 乳腺癌干细胞的发现

2003年，Marsden等[2]学者通过对乳腺癌细胞进行异种间移植，建立动物模型，第一次通过实验证明了乳腺癌干细胞的存在。他们从乳腺癌患者的恶性胸腔积液中分离出一类具有特殊表型的细胞，即CD44+CD24-/low，移植到NOD/SCID免疫缺陷小鼠体内，发现这群细胞只需200个就能在NOD/ SCID小鼠中成瘤，移植瘤的细胞组成和性质与致瘤细胞相同，并同样有较强的致瘤性，而其他表型的肿瘤细胞10 000个也不能形成肿瘤。表示这类细胞可能具有自我更新能力和分化潜能。而Shipitsin等[3]的研究也发现CD44+CD24-/low可作为乳腺癌干细胞的标志，并且是乳腺癌患者评价预后的独立危险因素。现在已普遍将CD44+CD24-/low作为乳腺癌干细胞的表面标志物，另外还可以与ESA、ALDH1、CDl33等表型和一些特定的受体整合素家族成员结合，都可以作为乳腺癌干细胞表面的标记物。

关于肿瘤干细胞的起源学说目前尚有诸多争论，但较为公认的有以下两种假说：（1）部分已经开始分化的祖细胞或已进一步分化为较为成熟的细胞在损伤或致癌等外在有害因素的作用下，某些基因经历致癌突变，获得自我更新能力，形成肿瘤干细胞[1，4]。（2）由已具有自我更新能力的正常乳腺干细胞获得恶性突变转化而来，因为干细胞存活时间较长，细胞周期中能经历累积更多的恶性突变，最终转变成肿瘤干细胞。

2 乳腺癌干细胞的鉴定和分离

由于乳腺癌组织中乳腺癌干细胞的含量很低，所以想要进一步研究乳腺癌细胞，首先要将乳腺癌干细胞从普通乳腺癌细胞中分离鉴定、富集纯化。

2.1 乳腺癌干细胞表面经典标志CD44+CD24-/low利用乳腺癌干细胞表面分子标志CD44+CD24-/low进行流式细胞筛选，可以快速分离并纯化乳腺癌干细胞。2003年，Marsden 等[2]首次通过流式细胞技术从9例原发性乳腺癌中通过表面标志分选出肿瘤细胞，接种于NOD/SCID小鼠。根据致瘤能力先筛选出CD44+和CD24-两个标志抗原，再通过对各种抗原进行组合，最终筛选出了致瘤能力最强的标志：ESA+CD44+CD24-/low。具有该标志的细胞亚群最低仅100个肿瘤细胞即可致瘤NOD/SCID小鼠，从移植瘤中分离出的ESA+CD44+CD24-/low细胞亚群还可在NOD/SCID小鼠体内重新建出具有相同表面标志的癌组织。

2.2 乳腺癌干细胞标志物乙醛脱氢酶1（ALDH1） 2007年，Ginestier等[5]发现ALDH1也可作为筛选乳腺癌干细胞的标志物。实验人员采用了一种名称为ALDEFLUOR的试剂来检测细胞的ALDH1活性。结果显示，无论在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中，只有ALDH1阳性的细胞才具有类似干细胞的特性。并且通过进一步的研究结果表明，只有ALDH1阳性细胞才能致瘤。研究者使用5万个ALDH1阴性细胞却不能形成肿瘤，而与之形成对比的是，仅仅用500个ALDH1阳性细胞就可以形成肿瘤。而细胞中同时表达ALDH1与CD44+CD24-/low两组表面分子标志的亚群，最少仅需20个细胞即可形成肿瘤。此外，研究者还发现，肿瘤细胞中ALDH1阳性表达的患者预后最差，总体生存率较低，可造成远处转移的发生率是ALDH1阴性肿瘤患者的1.76倍。这表明ALDH1还可能与乳腺癌的预后存在密切关系，在判断预后方面具有潜在价值。

2.3 SP（side population）细胞亚群 有学者认为，肿瘤干细胞处于相对静止期，细胞膜表面高表达ATP结合盒转运蛋白（ABCG2）等ABC转运子，能将DNA增补性荧光染料Hoechst33342泵出而使细胞不被染色，但其他细胞不具有此功能[6-7]。利用荧光染色结合流式细胞分选技术，将没有荧光、未被染色的细胞分选出来，即为SP细胞。正常乳腺组织中分离出的SP细胞，在悬浮培养状态下生长可形成细胞微球，移植到小鼠身上能够生成完整的乳腺组织，提示可能在SP细胞中乳腺干细胞含量较高[8]。并且，在乳腺癌细胞株中分离出的SP细胞接种于免疫缺陷小鼠时，发现其具有较强致瘤能力，提示这类SP细胞中可能富含乳腺癌干细胞。但该荧光染料对细胞的毒性削弱了这种分选方法的可靠性。

2.4 乳腺微球体培养法 研究表明，已分化的细胞不能在无血清培养基上正常生长，而乳腺癌细胞可以在含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）的无血清培养液中悬浮生长并形成微球体，该微球体中富含CD44+CD24-/low细胞，不表达分化标志物，当在分化条件下培养时，表现多系分化的能力，致瘤性也明显增强，并且此微球体经酶分解后可连续传代，表明无血清悬浮培养法可成功分离出乳腺癌干细胞，并已成为体外培养乳腺癌干细胞的一种常规方法[9-10]。

除上述方法外，还有人发现CD133、CD49、整合素α6等也有可能作为肿瘤干细胞表面标志。前述方法虽然可以对乳腺癌干细胞进行筛选分离，但因为细胞表面标志与肿瘤干细胞自我更新及分化特性之间的联系尚不明确，所以细胞表面标志不能单独作为鉴定肿瘤干细胞的标准。在2006年美国癌症研究协会主办的肿瘤干细胞研讨会上，Clarke等[11]提出鉴定肿瘤干细胞的金标准是连续传代的动物移植瘤模型，因其最能满足定义干细胞的2个关键特性——自我更新和分化，从而在功能上鉴定肿瘤干细胞。

3 乳腺癌干细胞的信号通路

通常情况下，乳腺干细胞的更新、分化能力受到信号通路和激素的严格调控，当该机制发生异常或被破坏时，就会导致细胞分化异常，生长、繁殖不受控制，即形成了乳腺癌干细胞。目前已知的参与乳腺癌干细胞自我更新调控的信号通路主要包括Wnt、Notch和Hedgehog通路[12]。除此，近年来还发现PI3K/AKT、Jak/STAT、SDF-1-CXCR4等通路可能也与乳腺癌干细胞有密切关系。

3.1 Wnt信号通路 Wnt信号通路是肿瘤发生的经典通路，在乳腺干细胞维持自我更新和抑制分化中起重要作用。研究表明，在MMTV-Wnt转基因小鼠乳腺癌中，干细胞标志物的表达升高[13]。Wnt通路致癌的关键，是β-catenin降解障碍使得细胞质内游离的β-catenin聚集，然后与TCF/LEF-1结合进入细胞核，激活下游靶基因c-myc、cyclinD1的转录，进而导致了肿瘤的发生[14-16]。

3.2 Notch信号通路 澳大利亚的Bouras等[17]研究者发现，Notch信号途径在调控乳腺干细胞功能和乳腺上皮层中发挥重要作用，该信号通路的异常激活将促进腔上皮祖细胞的自我更新和转化，正常的Notch信号对乳腺干细胞的增殖起一定限制作用。同时，研究者还发现，在导管上皮中Notch会被预先激活，表明Notch信号对腔上皮祖细胞的作用有特异性，腔上皮祖细胞等的扩展将导致增生肥大及肿瘤等发生。Notch信号通路在促进乳腺干细胞保持其自身更新和增殖方面起重要作用，该通路的异常激活与早期乳腺癌发生及肿瘤复发有关。

3.3 Hedgehog信号通路 Hedgehog信号通路成员包括Shh （Sonic Hedgehog）、Patch1受体转录因子Gil1等[18]。Patch1、Gil1等Hedgehog途径成员在正常乳腺癌干细胞或祖细胞中高表达，当细胞被诱导分化时，Patch1、Gil1等的表达出现下调。Kasper等[19]研究发现，CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞中，Hedgehog信号通路的激活，引起Patch1、Gil1等mRNA表达量异常升高，并且，Hedgehog途径和乳腺癌干细胞的细胞间隔形成以及细胞和基质间的相互作用有关，可能是参与乳腺癌干细胞脱离基底膜和远处转移的过程。

4 乳腺癌干细胞与临床应用

自1990年以来，乳腺癌的死亡率呈下降趋势，但其降低一方面是因为诊断方法的改进，而另一方面是因为乳腺癌早期辅助疗法的提高[20]。而乳腺癌转移后的存活率几乎没有变化。乳腺癌干细胞的发现及对其生物学行为的研究，能更好地解释肿瘤耐药和复发及远处转移等问题，为乳腺癌的治疗指明了新方向。

4.1 乳腺癌干细胞与肿瘤的侵袭、转移 肿瘤干细胞具有迁移特性，与肿瘤的侵袭、转移密切相关。Balic等[21]对早期乳腺癌骨髓转移患者的骨髓标本进行分析发现，在肿瘤微小转移灶中，表达CD44+CD24-/low的乳腺癌细胞占很高比例，而原发部位中该细胞很少，提示具有干细胞性质的CD44+CD24-/low细胞可能在肿瘤的转移中起重要作用，早期乳腺癌患者骨髓中可能已经存在转移的乳腺癌干细胞，因而导致治疗后的复发或转移。

目前提出的乳腺癌干细胞导致肿瘤转移的机制包括：（1）与其他表型乳腺癌细胞相比，乳腺癌干细胞中与侵袭相关的基因和蛋白（IL-6，IL-8，TL-1a和UPA）表达更高水平，显示更强的侵袭性。（2）乳腺癌干细胞表面高表达特异性趋化因子受体CXCR4，而其配体SDF-1在乳腺癌常见转移部位如肺、骨、肝、淋巴结等处高表达，两者的特异性结合可使乳腺癌干细胞进入特定的靶器官增殖分化形成转移瘤。

4.2 乳腺癌干细胞与治疗抵抗性 乳腺癌干细胞已被证实具有较强的放、化疗抵抗性[22-23]。目前的治疗只是杀死了大部分普通增殖性乳腺癌细胞，对耐受力强的乳腺癌干细胞作用较小。目前一般认为乳腺癌干细胞对化疗药物和放疗耐受的机制主要包括：（1）化疗药物和放射线主要杀伤的是处于DNA合成期的细胞，而乳腺癌干细胞常处于静止期，属于慢分裂细胞，大部分处于细胞周期的静息状态G0期，对化疗药物和放射线具有更强的耐受性。（2）乳腺癌干细胞表面高表达ATP结合盒转运蛋白（ABCG2）等ABC转运子，能将化疗药物泵出而使干细胞免受损伤。（3）乳腺癌干细胞所处的特殊微环境，低氧干细胞巢-壁龛不仅能为肿瘤的快速生长提供必要的营养物质，也可以保护乳腺癌干细胞免受抗癌药物、放射线的攻击[24]。（4）乳腺癌干细胞具有很强的DNA修复机制，相关酶蛋白活性增高，可以修复放、化疗引起的基因损伤，抑制其凋亡[25]。（5）细胞信号通路被证实与乳腺癌干细胞的治疗抵抗性有关，如Notch-1信号通路可促进抗细胞凋亡基因BIRC5的表达，从而抑制了化疗药物和放射线诱导的细胞凋亡[26]。（6）乳腺癌干细胞高表达抗凋亡基因如bcl-2等，使细胞凋亡受到抑制而导致肿瘤细胞耐药。

4.3 乳腺癌干细胞与治疗 目前的乳腺癌治疗方法是以杀死或清除一切肿瘤为目的。但是研究发现放、化疗对乳腺癌干细胞亚群的疗效非常有限，经过治疗后，这群肿瘤干细胞的增殖、分化会促使肿瘤复发和转移。因此，除手术外传统的治疗方法对乳腺癌干细胞作用的研究，为进一步的研究奠定了基础。

4.3.1 乳腺癌干细胞与化疗 肿瘤干细胞的细胞周期长、代谢慢，因此对抗有丝分裂药物的耐受性较高。Gupta等[27]研究发现，沙利霉素杀死乳腺癌干细胞的能力比普通的化疗药物如最常用的紫杉醇强100倍。经过沙利霉素预处理的肿瘤干细胞注入到小鼠体内，致瘤几率明显较紫杉醇预处理的肿瘤干细胞降低，并且移植瘤的生长速度也明显变慢。由于乳腺癌干细胞具有将化疗药物排除细胞外的能力等多种原因，因而比普通癌细胞具有更强的耐药性，所以，如何增强肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性是化学药物治疗首要解决的问题之一。

4.3.2 乳腺癌干细胞与内分泌治疗 内分泌治疗对于ER阳性乳腺癌患者来说是十分重要的辅助治疗方法。因此对于ER阳性乳腺癌，雌激素和各种抗雌激素的药物对乳腺癌干细胞的作用至关重要，其可能决定着乳腺癌内分泌治疗的成败。许健等[28]曾采用ER阳性的乳腺癌细胞系MCF-7来研究雌二醇（E2）和拮抗剂他莫昔芬（TAM）对乳腺癌干细胞亚群（CD44+CD24-/low细胞）数量的影响。发现在不同浓度E2作用下，MCF-7中乳腺癌干细胞亚群的含量增加，而在相同浓度的E2作用下，加入TAM能够使MCF-7中乳腺癌干细胞亚群的含量降低。表明，内分泌治疗对于乳腺癌干细胞可能有抑制作用，但是内分泌治疗的作用机制很复杂，很多仍还处于探索阶段。

4.3.3 乳腺癌干细胞和靶向免疫治疗 目前认为肿瘤干细胞是肿瘤免疫的盲区，因为在肿瘤免疫学研究中有以下困难：（1）肿瘤干细胞数量极少，不足以表达足够抗原量而致敏相应特异性T细胞；（2）肿瘤干细胞生存的壁龛环境使抗原提呈细胞难以捕获到其抗原；（3）肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞可能有共同的抗原表达，致敏激活的特异性T细胞易与普通肿瘤细胞接触，但难以识别并杀伤肿瘤干细胞。王小利等[29]发现携带癌胚抗原基因（CEA）的重组人腺相关病毒（rh-AAV）感染树突状细胞诱导获得的抗原特异性细胞毒性T细胞，可以杀伤表达CEA的乳腺癌细胞，对CD44+CD24-/low细胞也具有一定的杀伤活性。说明免疫治疗在治疗乳腺癌干细胞方面也有潜在发展可能。

能否靶向消除乳腺癌干细胞是能否根治乳腺癌的关键，目前相关靶向治疗还有miRNA介导的基因治疗、溶瘤病毒感染杀死CD44+CD24-/low细胞和对乳腺癌干细胞的诱导分化等方法。

5 结语

乳腺癌干细胞的发现解释了乳腺癌的本质，为探求乳腺癌的发生根源提供了帮助，也为乳腺癌的根治指明了新的研究方向。通过靶向杀伤乳腺癌干细胞彻底治疗乳腺癌已经引起医学界的重视并取得了一定成果，但对于乳腺癌干细胞的研究仍然存在很多问题，其生物学特性、基因调控机制尚不明确，仍未发现更精确的乳腺癌干细胞表面标志物。但相信随着对乳腺癌干细胞研究的深入以及相关靶向药物的研发，将会为乳腺癌治疗带来革命性的变化，有望实现消除乳腺癌干细胞、彻底根治乳腺癌的目标。

[1] Bonnet D，Dick J E.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nature Medicine，1997，3（7）：730-737.

[2] Marsden C G，Wright M J，Pochampally R，et al.Breast tumorinitiating cells isolated from patient core biopsies for study of hormone action[J].Methods in molecular biology（Clifton，N.J.），2009，125 （590）：363-375.

[3] Shipitsin M，Campbell L L，Argani P，et al.Molecular definition of breast tumor heterogeneity[J].Cancer Cell，2007，11（3）：259-273.

[4] Passegué E，Jamieson C H M，Ailles L E，et al.Normal and leukemic hematopoiesis：are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics?[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100（suppl 1）：11842-11849.

[5] Ginestier C，Hur M H，Charafe-Jauffret E，et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J].Cell Stem Cell，2007，1（5）：555-567.

[6] Goodell M A，Brose K，Paradis G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo[J].The Journal of Experimental Medicine，1996，183（4）：1797-1806.

[7] Sleeman K E，Kendrick H，Ashworth A，et al.CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial，myoepithelial/basal and non-epithelial cells[J].Breast Cancer Research，2005，8（1）：R7.

[8] Alvi A J，Clayton H，Joshi C，et al.Functional and molecular characterisation of mammary side population cells[J].Breast Cancer Res，2003，5（1）：1-8.

[9] Ponti D，Costa A，Zaffaroni N，et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties[J].Cancer Research，2005，65（13）：5506-5511.

[10] Phillips T M，McBride W H，Pajonk F.The response of CD24-/low/ CD44+breast cancer-initiating cells to radiation[J].Journal of the National Cancer Institute，2006，98（24）：1777-1785.

[11] Clarke M F，Dick J E，Dirks P B，et al.Cancer stem cellsperspectives on current status and future directions：AACR Workshop on cancer stem cells[J].Cancer Research，2006，66（19）：9339-9344.

[12] Beachy P A，Karhadkar S S，Berman D M.Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis[J].Nature，2004，432（7015）：324-331.

[13] Stingl J，Eirew P，Ricketson I，et al.Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells[J].Nature，2006，439 （7079）：993-997.

[14]马源，王红霞.乳腺癌干细胞信号传导通路及以其为靶点的干细胞治疗[J].中华肿瘤杂志，2010，32（12）：881-885.

[15] Roarty K，Rosen J M.Wnt and mammary stem cells：hormones cannot fly wingless[J].Current Opinion in Pharmacology，2010，10（6）：643-649.

[16] Pece S，Serresi M，Santolini E，et al.Loss of negative regulation by numb over notch is relevant to human breast carcinogenesis[J].The Journal of Cell Biology，2004，167（2）：215-221.

[17] Bouras T，Pal B，Vaillant F，et al.Notch signaling regulates mammary stem cell function and luminal cell-fate commitment[J].Cell Stem Cell，2008，3（4）：429-441.

[18] Ogden S K，Ascano Jr M，Stegman M A，et al.Regulation of Hedgehog signaling：a complex story[J].Biochemical Pharmacology，2004，67（5）：805-814.

[19] Kasper M，Jaks V，Fiaschi M，et al.Hedgehog signalling in breast cancer[J].Carcinogenesis，2009，30（6）：903-911.

[20] Calvocoressi L，Sun A，Kasl S V，et al.Mammography screening of women in their 40 s[J].Cancer，2008，112（3）：473-480.

[21] Balic M，Lin H，Young L，et al.Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype[J].Clinical Cancer Research，2006，12（19）：5615-5621.

[22] Hambardzumyan D，Squartro M，Holland E C.Radiation resistance and stem-like cells in brain tumors[J].Cancer Cell，2006，10（6）：454-456.

[23] Shafee N，Smith C R，Wei S，et al.Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors[J].Cancer Research，2008，68（9）：3243-3250.

[24] Li L，Neaves W B.Normal stem cells and cancer stem cells：the niche matters[J].Cancer Research，2006，66（9）：4553-4557.

[25] Frosina G.DNA repair and resistance of gliomas to chemotherapy and radiotherapy[J].Molecular Cancer Research，2009，7（7）：989-999.

[26] Sajithlal G B，Rothermund K，Zhang F，et al.Permanently blocked stem cells derived from breast cancer cell lines[J].Stem Cells，2010，28（6）：1008-1018.

[27] Gupta P B，Onder T T，Jiang G，et al.Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening[J].Cell，2009，138（4）：645-659.

[28]许健，王水，许立生，等.雌激素对MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群影响的实验研究[J].中华肿瘤防治杂志，2007，14（9）：650-652.

[29]王小利，马博，贾军，等.rAAV/CEA转染树突状细胞诱导特异性CTL杀伤MCF-7细胞系CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞[J].北京大学学报（医学版），2011，43（2）：173-178.

Status of the Study on Breast Cancer Stem Cells/

SU Ying-ying，WANG Fu-sheng.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：143-146

For women，breast cancer is a severe threat to health and the number one killer of life currently，there are a number of studies suggest that breast cancer may originated in the breast cancer stem cells.Hypothesis of breast cancer stem cell put forward a more reasonable explanation of the biological behavior of breast cancer such as its initiation，recurrence and metastasis，provide a new direction to therapy of breast cancer.

Breast cancer； Breast cancer stem cell； Signal pathway； Therapy

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.056

2014-01-25） （本文编辑：欧丽）

山西省科技攻关项目（20130313021-11）

①山西医科大学第二附属医院 山西 太原 030001

王伏生

First-author’s address：The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China