癫痫患者脑脊液和血清中miRNA-184 的表达

杨武芬，刘 华，郑 颖，韩雁冰，任 惠

癫痫(Epilepsy)是一组由已知或未知病因所引起的脑部神经元高度同步化异常放电所导致的综合征，其临床表现以反复性、发作性、短暂性、刻板性的中枢神经系统功能失常为特征，表现为发作性的感觉、运动、意识、精神、行为、自主神经功能障碍，或兼有之。流行病学调查显示，癫痫在一般人群中的发病率为(50～70)/10 万，患病率为0.4%～1%［1］。在癫痫发病过程中，反复痫性发作可造成脑组织缺血缺氧、水肿诱发兴奋性氨基酸释放、钠钙内流，从而启动Caspase 级链反应等，产生了自由基、神经一氧化氮合酶以及介导凋亡的核心执行蛋白激酶Caspase-3，使细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活，造成大量神经元凋亡、缺失，而这些神经元损伤是导致慢性自发性癫痫发生的原因之一，最终可能形成难治性颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)。通过观察神经元损伤敏感标志物神经特异性烯醇化酶表达发现癫痫发作导致海马区锥体神经元脱失，是神经元损伤的结果，且发作级别越高，损伤越大［2］。癫痫动物模型研究表明，癫痫发作可导致海马、杏仁核、大脑皮质、丘脑及小脑等部位神经元的丧失［3］。

MicroRNAs(miRNAs)是1993 年发现的一种长度为20～24 个核苷酸的内源性非编码蛋白的小RNA 基因，主要是通过与靶基因的3’端非翻译区(3’untranslated regions，3’-UTR)互补配对抑制靶基因转录后表达，抑制mRNA 翻译或使mRNA 降解。已发现的miRNA 中，约70%在哺乳类动物的脑组织中有表达，在神经系统的不同生理过程、不同信号传导通路的基因表达调控过程中发挥重要作用，如神经系统发生和发育、神经干细胞分化、细胞凋亡等过程中发挥重要作用［4］。研究发现miRNA-184 主要表达于海马CA3区和CA1区，而且通过抑制AKT2的表达来抑制神经元的凋亡［5］，通过与甲基化CPG结合蛋白1(MBD1)和Numb1 相互调节，来维持aNSCs 的增殖与分化的平衡［6］。由于癫痫患者人脑组织取材困难，及时取得标本，对人离体脑组织进行直接检测miRNA 的表达也极为不易，而脑脊液主要产生于侧脑室的脉络丛组织中，且包绕脑实质、与脑细胞外隙直接接触，可以动态反映脑组织内病理生理变化。因此，我们拟以脑脊液和血清为研究对象，观察体液中miRNA-184 的变化与脑组织中miRNA-184表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 所有研究对象均为2010 年2月～2013 年1 月在昆明医科大学第一附属医院的住院患者，共78 例。分为两组:(1)癫痫组:所有入选的癫痫患者的诊断均符合1989 年ILAE 提出的癫痫及癫痫综合征分类诊断标准和脑电图的表现。(2)对照组:共39 例，入选标准为:①年龄、性别与癫痫组患者匹配;②排除既往及现在的癫痫发作病史。

1.2 标本的采集 确诊为癫痫，且在癫痫发作后0～15 d 之内，进行腰椎穿刺，留取脑脊液2 ml 同时抽取外周血3～4 ml，在留取标本后6 h 之内用微离心机离心(3000 r/min，离心10 min)，取血清和脑脊液上清分开放入EP 管内，每个EP 管至少放200 μl，保存至-80 ℃冰箱。在相同时间内抽取非癫痫病住院患者的脑脊液和外周血，进行上述处理。整个过程中使用的器械均进行去RNA 酶处理。

1.3 荧光定量PCR 取-80 ℃保存的脑脊液和血清室温下解冻，提取总RNA，采用miRNeasy Serum/Plasma Kit 试剂盒(QIAGEN 公司)，按操作说明书抽提。提取的总RNA 样本中加入RNase-free 水完全溶解RNA 沉淀后，保存在-80 ℃ 冰箱中。RNA 的浓度和纯度用260/280 nm 检测，260/280 nm在1.8～2.0 之间可以用于后续实验。反转录实验采用QIAGEN 公司的反转录试剂盒，步骤为:(1)37 ℃for 60 min;(2)95 ℃ for 5 min。本实验选miRNA-16［7］作为血清的内参，以miRNA-24［8］作为脑脊液内参平衡样本量。荧光定量PCR 扩增反应的miRNA-184、miRNA-16、miRNA-24 特异性环茎状引物购买于QIAGEN 公司。反应在96 孔PCR 板中进行，每个反应做3 个复孔。PCR 反应体系为20 μl，SYRB Green 荧光染料(QIAGEN 公司)10 μl，上下游引物各2 μl，去RNase 的纯净水4 μl，CDNA模板2 μl。反应条件为:(1)95 ℃，15 min;(2)94 ℃，15 s;(3)55 ℃，30 s;(4)70 ℃，34 s;(5)在第2～4 步间循环45 次。在Applied Biosystems 7300 扩增仪上进行扩增。结果用平均2-ΔCt±标准差计算。表达量的相对倍数用癫痫发作后2-ΔCt/对照2-ΔCt计算。

1.4 统计分析 全部数据统计分析采用SPSS 18.0 统计软件，对各组脑脊液和血清中miRNA-184的表达量，使用软件分析计算阈值(Ct)，2-ΔCt(ΔCt=目标基因的CT 值-内参基因的CT 值)来比较两组中miRNA-184 表达的不同，用±s 表示，多组之间的比较采用配对样本t 进行检验，两组中P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人口学资料 本研究共纳入78 例患者，其中癫痫组和非癫痫对照组患者各39 例，两组间年龄、性别无统计学差异(见表1)。

2.2 实时定量PCR 结果 miRNA-184 在癫痫患者及非癫痫患者脑脊液中的表达情况见表2 和图1。miRNA-184 在癫痫患者脑脊液中表达水平明显高于非癫痫患者(P＜0.05)，且表达量增高4.67倍。miRNA-184 在癫痫患者及非癫痫患者血清中的表达情况见表3 和图2。miRNA-184 在癫痫患者血清中表达水平明显低于非癫痫患者(P=0.029＜0.05)。对比miRNA-184 在癫痫组与非癫痫组脑脊液和血清中的表达，发现癫痫患者脑脊液和血清中miRNA-184 的表达成相反的趋势。

表1 癫痫组和对照组患者的人口学资料

表2 荧光定量PCR 测定miRNA-184 在癫痫患者与非癫痫患者脑脊液中的表达(±s)

表2 荧光定量PCR 测定miRNA-184 在癫痫患者与非癫痫患者脑脊液中的表达(±s)

经两独立样本t 检验，癫痫组与对照的miRNA-184 在脑脊液中的表达有统计学差异，P=0.011＜0.05

表3 荧光定量PCR 测定miRNA-184 在癫痫患者与非癫痫患者血清中的表达(±s)

表3 荧光定量PCR 测定miRNA-184 在癫痫患者与非癫痫患者血清中的表达(±s)

经两独立样本t 检验，癫痫组与对照的miRNA-184 在血清中的表达有统计学差异P=0.029＜0.05

图1 miRNA-184 在脑脊液中的表达对比

图2 miRNA-184 在血清中的表达对比

3 讨论

癫痫发作可诱导脑细胞的凋亡，在癫痫持续状态下海马神经元凋亡明显［9］。以往研究发现，Akt的激活可以保护癫痫所诱导的海马神经元的凋亡［10］。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)是存在于神经细胞的一种苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，其Thr308 和Ser473 位点能在PI3K 作用下磷酸化而激活，随即发挥抗细胞凋亡、促细胞生存等多种生物效应［11］。癫痫发作后海马神经元内Akt 与miRNA-184 的表达成互惠模式，且miRNA-184 可能通过促进AKT2 的表达来抑制神经元的凋亡［5，12］。

Sato 等［13］研究发现，痫性发作诱导损伤后，在尾侧脑室下区、胼胝体间区和海马的CA1和CA3区神经干细胞增殖和迁移，出现了神经发生和可塑性改变。而癫痫持续状态能够加速尾侧脑室下区aNSCs的增殖，其增殖与海马的病理状态有密切关系。liu 等［6］也曾报道，成熟的miRNA-184 局限于成人两个持续神经元形成的区域内，分别是侧脑室室管膜下和海马齿状回，miRNA-184 表达较高的区域具有较强的荧光信号。在神经系统中，miRNA-184通过与甲基化CPG 结合蛋白1(MBD1)和Numb1 相互调节，来维持aNSCs 的增殖与分化的平衡［6］。MBD1 主要表达于分化性aNSCs 和原代皮质神经元细胞中，而miRNA-184 主要表达于增殖性aNSCs中，而且，MBD1 通过直接与miRNA-184 周边的基因结合而抑制aNSC 中miRNA-184 的表达，维持aNSC的增殖和分化的平衡［6］。外源性的Numbl 可以营救由miRNA-184 的过度表达或MBD1 所致的神经干细胞的缺失［14］。

以上资料说明，癫痫发作后脑组织内miRNA-184 的表达明显升高，这与本研究发现癫痫患者脑脊液中miRNA-184 的表达明显高于对照组相一致。由于癫痫患者人脑组织取材困难，及时取得标本，对人离体脑组织进行直接检测miRNA 的表达也极为不易，而脑脊液主要产生于侧脑室的脉络丛组织中，不断产生又不断被吸收回流至静脉，包绕脑实质、与脑细胞外隙直接接触，可以动态反映脑组织内病理生理变化，而且，脑脊液具有采集方便，创伤性小，可早期发现脑组织的病理变化的特点。因此，观察癫痫患者脑脊液中可溶性分子生物标志物，可能是研究脑实质病变的的有效途径之一。

本研究还发现，癫痫患者血清中miRNA-184 的表达明显低于对照组。这可能是因为癫痫发作促使外周血血清中的miRNA-184 向颅内流动所致。癫痫发作时血脑屏障内皮、基膜、周细胞都出现明显的水肿，基膜电子密度降低;内皮吞饮小泡、微绒毛明显增多，内皮细胞间的连接断裂等改变［15］。促使BBB 破坏，BBB 通透性升高，内皮细胞从血浆内摄取、转运物质的能力增强，导致脑脊液可出现正常或不正常的物质。因此，癫痫发作后外周血中的miRNA-184 可能透过血脑屏障进入脑脊液，到达相应区域发挥神经保护作用，所以，癫痫患者外周血中miRNA-184 的表达明显低于对照组。但miRNA-184具体如何进入脑脊液的途径还尚不清楚，有待进一步的研究。

本课题研究了miRNA-184 在癫痫患者体液中的表达情况，首次报道了miRNA-184 在癫痫患者脑脊液和血清中的表达变化。虽然，近年来的研究表明神经特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)是目前唯一能特异性反映神经元损伤的生物标志物。其在血清和脑脊液中的水平可反映神经元受损的程度，对早期直接而准确地了解脑损伤程度，具有重要的临床意义。但NSE 是一种主要存在于大脑神经细胞的胞质中的特异性蛋白，NSE 检测极易受标本放置时间影响，标本放置时间只要超过2 h，就会对NSE 检测结果产生较大影响，NSE 的检测标本离心须在l h 内完成，NSE 的稳定性较差［16］。但在实际工作中，检验项目申请、患者准备、原始标本的采集、运送到实验室等工作是由实验室以外工作人员完成的，实验室工作人员很难控制，而标本的质量是准确检验结果的基础。由于这些检验前不可控因素的影响，同一患者检查结果出现显著差异时有发生，影响检验结果的真实性和准确性。而体液和组织中的miRNA 因常与蛋白质等构成复合物存在，因此具有良好的抗RNase 降解能力，血清样本置于室温4 h 后检测其miRNAs，发现与即刻检测样本相比miRNAs 量并未发生显著的改变:而且即便血清经过2 次冻融处理，miRNAs 的量稍有变化，也并不影响对疾病的诊断［17］。因此，miRNAs 的稳定性较高，方便在临床实践中的应用。

综上所述，本研究发现癫痫患者脑脊液中miRNA-184 的表达明显高于非癫痫患者，这与miRNA-184 在癫痫发作后在脑组织中表达趋势相一致。而癫痫发作后miRNA-184 在癫痫患者外周血清中的表达明显低于非癫痫患者。癫痫发作后miRNA-184在癫痫患者脑脊液和外周血清中的表达成相反的趋势。这说明在癫痫发作过程中miRNA-184 起一定的作用，提示观察体液中miRNA-184 的变化可能是观察癫痫患者脑组织病变的一个新的窗口。此项研究为进一步揭示癫痫发生发展机制提供了新的研究基础，并可能成为临床药物治疗癫痫的新靶点。但是，由于本课题研究的时间有限和病例数相对较少，关于miRNA-184 的表达在癫痫发作过程中如何随着时间的变化而发生改变，且miRNA-184 的表达与癫痫发作类型的相关性还有待进一步的研究。

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