声触诊组织定量技术评估兔慢性肾病肾纤维化的实验研究

陆 敏LU Min

杜联芳1DU Lianfang

王迎春2WANG Yingchun

徐 荣2XU Rong

论著 Original Research

声触诊组织定量技术评估兔慢性肾病肾纤维化的实验研究

陆 敏1,2LU Min

杜联芳1DU Lianfang

王迎春2WANG Yingchun

徐 荣2XU Rong

目的建立新西兰兔慢性肾病模型，应用声触诊组织定量（VTQ）技术监测兔慢性肾病的发展，为VTQ评估慢性肾病肾纤维化提供实验依据。材料与方法选取38只健康新西兰大白兔，其中32只每天经耳缘静脉注射阳离子牛血清白蛋白（C-BSA）诱导慢性肾病模型，另外6只未注射C-BSA设为对照组。于0周、2周、4周、6周、8周采用VTQ测量兔肾皮质硬度，随后解剖兔，评估肾脏的病理变化，并分析VTQ参数与病理参数的相关性。结果兔肾皮质0周、2周、4周、6周、8周的VTQ值分别为（1.68±0.25）m/s、（1.70±0.31）m/s、（1.87±0.35）m/s、（2.19±0.31）m/s、（2.46±0.46）m/s，6周VTQ值与4周比较差异有统计学意义（P＜0.05），8周VTQ值与4周、6周比较差异有统计学意义（P＜0.05）。4周、6周、8周肾小球硬化指数分别为0.81±0.40、1.43±0.46、2.15±0.46，肾间质胶原纤维面积分别为（14.29±4.62）%、（26.28±11.06）%、（42.37±10.09）%，均明显高于0周、2周，且纤维化随病程进展逐渐增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。肾皮质VTQ与肾小球硬化指数、肾间质胶原纤维面积呈正相关（r= 0.663、0.652, P＜0.05）。结论VTQ可以检测到兔慢性肾病发展过程中肾皮质硬度增高，与肾纤维化呈正相关，提示VTQ可以成为评价肾纤维化的重要方法。

肾疾病；慢性病；纤维化；超声检查，多普勒，彩色；声触诊组织量化技术；疾病模型，动物；兔

慢性肾脏疾病是常见的临床疾病，症状比较隐匿，若病因持续存在，最终将发展为不可逆的肾功能衰竭。肾纤维化是所有慢性肾脏疾病进展到肾功能衰竭的共同阶段，包括肾小球硬化和肾间质纤维化[1]。目前，肾组织活检是确定肾脏病理改变的唯一方法，但属于有创性检查，不宜重复操作和动态监测病变的发展过程。因此，寻找一种无创、客观的检查方法来评估慢性肾病肾脏纤维化程度尤为重要[2]。本研究拟在兔慢性肾病模型基础上，应用声触诊组织定量（virtual touch tissue quantifcation, VTQ）技术检测慢性肾病

进展中肾纤维化的变化，探讨慢性肾病模型肾组织质地的影像学参数与肾纤维化组织形态之间的相关性，为临床应用VTQ正确评价慢性肾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康新西兰大白兔38只，由上海药物研究所动物实验中心提供[动物生产许可证号SCXK（沪）2010-0027，质量合格证号0066975]，体重2.2～2.5 kg，均为雄性。单笼饲养，适应性喂养1周后进行实验。将32只健康新西兰大白兔作为实验组，按照注射阳离子牛血清白蛋白（C-BSA）不同时间点即注射C-BSA 2周、4周、6周、8周随机抽取，共分4个亚组，每组8只。另将6只健康新西兰大白兔设为对照组，未注射C-BSA即为0周。

1.2 C-BSA的制备 参照Border等[3]的方法，将普通牛血清白蛋白转化为C-BSA（由上海医药工业研究所提供）。将无水乙二胺67 ml加双蒸水500 ml，再加6 mol/L盐酸 350 ml，冷却至25℃，并调整pH值至4.75。将牛血清白蛋白 5 g溶于25 ml双蒸水中，与上述溶液混合，然后加碳化二亚胺1.8 g。将混合溶液继续维持原温度与pH值搅拌2 h，最后加入4 mol/L（pH值=4.75）醋酸缓冲液30 ml终止反应。在4℃双蒸水中透析48 h，最后用冷冻干燥机干燥为结晶粉末，分装保存于－40℃冰箱备用。

1.3 兔慢性肾病模型的建立 参考何立群等[4]的方法，将C-BSA l mg和大肠杆菌内毒素0.5 μg溶于2 ml生理盐水中，经兔耳缘静脉注射进行预免疫，1周后每天将C-BSA 25 mg溶于2 ml生理盐水中，经耳缘静脉注射进行致病免疫，持续8周。

1.4 VTQ超声检查 实验当天选用地西泮（安定）5 mg和氯胺酮10 mg，以3∶7制成混合溶液，按0.3 ml/kg注射于兔后腿肌肉丰满处进行麻醉，待动物安静后，剪去肾区体毛，侧卧位固定于实验台上。采用Siemens Acuson S2000彩色多普勒超声诊断仪，9L4探头，频率4～9 MHz；将仪器设置调节至VTQ模式，探查深度0.9～1.2 cm，对肾脏中极进行取样，自动获得该处肾皮质弹性VTQ值，重复10次，取其平均值。

1.5 肾脏组织病理学检查 解剖肾脏，置于10%甲醛溶液中固定，包埋，切片，行PAS染色和Masson染色。肾纤维化评估参考Raij等[5]的标准，肾小球硬化指数：0分：无肾小球硬化1分：肾小球硬化≤25%；2分：25%＜肾小球硬化≤50%；3分：50%＜肾小球硬化≤75%；4分：75%＜肾小球硬化≤100%。肾间质纤维化的评分：以双盲法应用Image-Pro Plus图像分析系统，对Masson染色图片进行分析。先在低倍镜下观察，每张切片至少观察20个不含肾小球和动脉的皮质区视野，然后取视野的中央，在200倍镜下留取图像。计算每个视野下蓝染区域占总视野面积的百分比，取平均值。取少量标本置于2.5%戊二醛固定，用于透射电镜观察基底膜电子致密物的沉积情况。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，VTQ参数与肾纤维化指标的相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验兔生存情况 正式免疫后6周、8周，实验兔出现精神不振，反应迟钝，出现不同程度的皮疹，掉毛。实验兔共死亡4只，其中第2周时1只因过量麻醉窒息死亡，第6周时1只因运输过程中挤压窒息死亡，第8周时2只因出现尿色改变、尿路感染死亡，2只出现少量腹腔积液。

2.2 VTQ参数比较 兔肾皮质VTQ值于2周、4周时略高于0周，但差异无统计学意义（P＞0.05），VTQ值在6周、8周时明显高于0周，且6周与4周比较差异有统计学意义（P＜0.05），8周与6周比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1及图1。

图1 VTQ于实验2周时检测兔肾脏

表1 兔慢性肾病发展过程中不同时间点的VTQ值比较

2.3 病理检查结果

2.3.1 肾脏组织透射电镜观察结果 未注射C-BSA（0周）时透射电镜下见肾小球毛细血管基底膜结构清晰，足突排列整齐，界限清晰。注射C-BSA后第2周时基底膜结构清晰，足突排列整齐。第4周活检见上皮细胞足突部分融合，上皮下仅见少量电子致密物。第6周活检见基底膜上少量电子致密物沉着，上皮细胞足突广泛融合。第8周见基底膜明显增厚，上皮下大量电子致密物沉积融合呈团块状，足突细胞部分变性，足突广泛融合、变平或消失。见图2。

图2 透射电镜显示不同时间点免疫复合物在基底膜的沉积情况。未注射C-BSA（0周）时，基底膜结构清晰，足突排列整齐（×7500,箭, A）；第2周时基底膜结构清晰，足突排列整齐（×7500, B）；第4周节段性足突融合，镜下基底膜可见少许电子致密物（×7500, C）；第6周镜下可见基底膜见少量电子致密物沉着，上皮细胞足突广泛融合（×7500, D）；注射C-BSA后8周，基底膜明显增厚，镜下可见大量电子致密物沉积融合呈团块状（×7500, E, 箭）

2.3.2 兔肾纤维化的变化 未注射C-BSA（0周）时：肾小球毛细血管攀开放良好，系膜区未见细胞和基质增生，未见明显复噬红物沉积，胞质内的红染物质分布均匀，肾间质胶原呈浅蓝色淡染，呈线状分布。注射C-BSA后，随病程进展肾小球硬化、肾小管间质纤维化逐渐增高（图3、4）。肾小球硬化指数4周与0周、2周相比，差异有统计学意义（P＜0.05），6周与4周相比、8周与6周相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。肾小管间质纤维化4周时均明显高于0周、2周，且纤维化随病程进展逐渐增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图3 兔肾皮质肾小球硬化随时间的变化。A为未注射C-BSA（0周）；B～E分别为注射C-BSA后2周、4周、6周、8周；随着时间的变化，镜下见肾小球胞质中蛋白性红色物质逐渐增多，肾小球系膜细胞，基质逐渐增多（PAS, ×200）

图4 兔肾皮质肾间质胶原纤维面积随时间的变化。A为未注射C-BSA（0周）；B～E分别为注射C-BSA后2周、4周、6周、8周；随着时间的变化，镜下可见肾间质蓝色淡染胶原纤维沉积逐渐增多（Masson, ×200）

表2 不同时间点兔肾小球硬化指数和肾间质胶原纤维面积的比较

2.4 VTQ参数与慢性肾病肾纤维化的相关性 随着注射C-BSA时间的延长，肾皮质VTQ与肾小球硬化指数、肾间质胶原纤维面积呈正相关（r=0.663、0.652，P＜0.05）。

3 讨论

VTQ是近年发展起来的定量评估组织弹性的超声成像新技术之一，它利用超声探头向感兴趣区发射推力脉冲，获得局部组织因形变而产生的剪切波速度，根据物理原理，组织越硬，产生的剪切波速度越大，VTQ测得的参数值越大。VTQ可以量化地反映组织的硬度，拓宽了超声诊断范围。目前，已将该项技术用于评估慢性肾病肾组织质地的临床研究[6-10]，但结果却不相同，对VTQ在肾纤维化评估中的作用尚存在争议[11-14]，但并无与之对照的病理学研究结果加以证实。

肾纤维化是各种慢性、进展性肾脏疾病的最终归宿，肾小球硬化和肾间质纤维化是主要病理基础[15]。本实验采用C-BSA诱导原位免疫复合物肾炎，建立兔慢性肾病模型。实验结果显示，注射C-BSA 4周，透射电镜显示足突形态改变，部分融合，6周时基底膜下见少量免疫复合物沉积，8周时基底膜增宽，免疫复合物沉积明显增加，提示第4周造模成功，随着注射时间的延长，病理改变逐渐加重。同时对肾皮质内微观结构肾小球和肾间质的变化进行定量分析，全面评价肾脏胶原含量的变化，结果发现，4周时肾小球硬化指数、肾间质胶原纤维面积均高于未注射C-BSA的0周，且随着病程进展亦呈逐渐增高的趋势。

生物组织的弹性或硬度很大程度上依赖于组织的分子构成以及这些分子构成块在微观、宏观上的组织形式[16]。组织硬度的变化与其病理变化密切相关，当组织发生病理变化时，其弹性或硬度也随之发生改变。VTQ技术正是通过检测肾皮质感兴趣区内组织的微小位移而分析出肾皮质的硬度。本研究结果显示，注射C-BSA第6周、8周，兔肾皮质VTQ值明显增高，且与肾小球硬化、肾间质胶原纤维面积呈正相关，提示VTQ值与肾纤维化程度密切相关，其原因可能为：带正电的C-BSA通过电荷结合的方式与富含负电荷的肾小球基底膜及循环中的抗体形成免疫复合物，种植于基底膜上并激活补体，可以直接破坏肾小球滤过屏障的完整性。随着病变的发展，肾小球内的基质成分增多，肾小球硬化程度增加，肾小管间质胶原纤维含量增加，肾纤维化程度加重，导致顺应性降低，肾组织变硬，VTQ值增大。因此，VTQ值可以反映慢性肾病肾组织微观形态学的改变，是监测肾脏组织结构病理改变较客观的指标。

VTQ作为近年临床应用的一项超声检测新技术，能定量反映组织结构的病理变化，在肝纤维化和肝硬化定量诊断中的应用已有报道[17-19]，但由于缺乏对肾纤维化程度统一的分级标准，有关VTQ值与肾内部微观结构相关性的文献并不多见[20]。尽管本研究表明VTQ可以间接反映肾纤维化程度，但是VTQ值测值不稳定，存在重叠现象，主要可能是由于肾脏自身的结构特点所致。肾脏内部结构相对复杂，VTQ取样框的大小不能改变，同时不可避免地受到呼吸的影响。因此，在VTQ测量肾组织硬度时，应该建立统一的标准，操作上更加规范统一。另外，本实验动物数量有限，未考虑观察者测量的变异性，需要进一步加大样本量，增强实验测量结果的稳定性和准确性。

总之，VTQ可以无创、客观地评价兔慢性肾病肾组织肾皮质的硬度， 肾组织VTQ值水平与肾组织的纤维化程度存在一定的相关性。VTQ技术有望成为监测和评估慢性肾病肾纤维化程度的一种新手段。

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（本文编辑 张春辉）

Renal Fibrosis Assessment in Rabbits with Chronic Renal Nephropathy Using Virtual Touch Tissue Quantifcation Technique: Experimental Study

PurposeChronic nephropathy model was established with New Zealand rabbit, and the development of chronic nephropathy was monitored using virtual touch tissue quantification (VTQ) technique, to provide the experimental basis for chronic renal fibrosis assessment using VTQ technique.Materials and MethodsThirty-eight healthy New Zealand white rabbits were selected, of which 32 were induced into chronic nephropathy model with daily intravenous ear vein injection of cationic bovine serum albumin (C-BSA), with the other 6 rabbits without C-BSA injection as control group. At the end of 0, 2, 4, 6, 8 weeks, VTQ was used to measure the hardness of renal cortex in rabbits, then the rabbits were slaughtered to assess the pathological changes in kidney, correlation analysis between the VTQ parameters and the pathological parameters was performed.ResultsVTQ value of rabbit kidney cortex at 0 week, 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks was (1.68±0.25) m/s, (1.70±0.31) m/s, (1.87±0.35) m/s, (2.19±0.31) m/s and (2.46±0.46) m/s respectively, difference of VTQ values between 6 weeks and 4 weeks was statistically signifcant (P＜0.05), and also signifcant when compared 8 weeks with 4 weeks and 6 weeks (P＜0.05). Glomerulosclerosis index of 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks were 0.81±0.40, 1.43±0.46 and 2.15±0.46 respectively, and tubular interstitial collagen deposition score were (14.29±4.62)%, (26.28±11.06)%, (42.37±10.09)%, which were all significantly higher than that in 0 week and 2 weeks, fibrosis increased gradually with the course, the difference was statistically signifcant (P＜0.05). Correlation analysis showed that the VTQ value of renal cortex was positively correlated with glomerulosclerosis index (r=0.663, P＜0.05) and tubular interstitial collagen deposition score (r=0.652, P＜0.05).ConclusionVTQ technique is able to detect the VTQ change of renal cortex as the disease progressed in rabbits with chronic renal nephropathy, which was in a positive association with fibrosis index, suggesting that virtual touch tissues quantitative technology can be an important method to evaluate renal fbrosis in chronic renal nephropathy.

Kidney diseases; Chronic disease; Fibrosis; Ultrasonography, Doppler, color; Acoustic radiation force impulse; Disease models, animal; Rabbits

1.上海交通大学附属第一人民医院超声科上海 200080

2.上海市嘉定区中心医院超声科 上海201800

杜联芳

Department of Ultrasound, the First People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200080, China

Address Correspondence to: Du Lianfang

E-mail: du_lf@163.com

国家自然科学基金项目（81171352）；

上海市卫生局科研课题项目（20134287）。

R-33；R445.1

2014-02-21

修回日期：2014-09-01

中国医学影像学杂志

2014年 第22卷 第9期：641-644，649

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(9): 641-644, 649

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.09.001