去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌细胞周期作用及分子机制的探讨

李维前，刘 霞，张守成

（1.徐州医学院附属第三医院病理科，江苏 徐州 221003；2.徐州市沛县人民医院病理科，江苏 徐州 221600）

· 继续教育 ·

去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌细胞周期作用及分子机制的探讨

李维前1，刘 霞1，张守成2

（1.徐州医学院附属第三医院病理科，江苏 徐州 221003；2.徐州市沛县人民医院病理科，江苏 徐州 221600）

目的研究去乙酰化酶抑制剂（MS-275）对乳腺癌细胞（MCF7）周期的作用及机制。方法0.5、1.0、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7细胞24 h，用噻唑蓝（MTT）观察不同浓度MS-275对MCF7细胞的生长抑制作用；流式细胞仪检测细胞生长及周期；Westernblotting检测MS-275对乳腺癌细胞周期相关基因的表达。结果1.0 μmol/L浓度的MS-275对MCF7细胞生长有抑制作用并呈现一定的量效关系，1.0 μmol/L浓度以上明显诱导阻滞乳腺癌细胞MCF7细胞周期，明显增加p21，p27基因的表达，明显降低 CCND1、CDK4D基因的表达。结论一定剂量的MS-275抑制乳腺癌MCF7细胞的生长，可通过调控多个细胞周期相关基因诱导乳腺癌细胞细胞周期阻滞，细胞阻滞的发生与p21，p27基因表达的增加及CCND1、CDK4D基因表达的减少相关。

去乙酰化酶抑制剂；细胞周期；基因的表达；乳腺癌细胞

MS-275对乳腺癌细胞周期作用的报告现有报道，本研究主要观察MS-275对乳腺癌MCF7细胞周期的影响，探讨MS-275 对MCF7细胞周期发挥作用的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

MS-275、RPMI-1640、ECL显色试剂盒购买于北京中杉公司；P21，P27，CyclinD1鼠抗人单抗、抗CDK4多抗购自美国Santa Cruz；流式细胞仪、蛋白垂直电泳仪购买美国Bio-Rad公司；乳腺癌细胞株MCF7由徐州医学院病理生理教研室提供 。

1.2 细胞培养

将MCF7细胞接种在RPMI-1640培养液（10﹪胎牛血清，青霉素、链霉素100U/mL），37℃、5%CO2孵箱内贴壁传代培养。取对数生长期的细胞处理后分组，实验组分为0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275。对照组为等浓度的二甲基亚砜（DMSO）。

1.3 细胞生长抑制试验MTT法检测细胞抑制率

分组：A组试验组，分别给予0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用，B组设计为空白对照组。

1.4 流式细胞术（FCM）检测MCF7细胞周期

MCF7细胞单纯用无血清的RPMI-1640培养24 h后，依照设计分组作用24 h，PBS洗涤3次，70%的冷乙醇4℃以下冻存固定24 h，离心后弃乙醇（3000 r/min，10 min），再加入1 mL PBS制成细胞悬液固定后，加入RnaseA酶（终浓度为10 μg/mL），常温放置30 min，用 50 μg/mL的 PI（碘化丙啶）染色，用流式细胞仪进行MCF7周期细胞检测。

1.5 Western-blotting检测P21、P27、CyclinD1、CDK4D蛋白的表达

Western-blotting检测MCF7肿瘤细胞表面各基因的表达量。

1.6 统计学处理

采用SAS 13.1统计软件处理，采用REGWQ法对方差分析有显著性差异的资料进行多组均数间的两两比较。设置检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 MS-275对乳腺癌MCF7细胞增殖影响

M T T比色法显示不同浓度M S-2 7 5处理MCF7细胞24 h后，与溶剂对照组相比，0.5 μmol/L MS-275组细胞的抑制率差异无统计学意义（P＞0.05），1.0 μmol/L MS-275处理的细胞抑制率明显增加，且随着MS-275作用浓度升高而作用加强（P＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度的MS-275对MCF7细胞增殖的影响（±s，n=6）

表1 不同浓度的MS-275对MCF7细胞增殖的影响（±s，n=6）

注：*与对照组比较，P＜0.05；#浓度组间两两比较，P＜0.05

MS-275（µmol/L）抑制率（%）对照组7.2±3.24 0.57.86±0.02 1.020.04±0.31*#1.526.47±0.28*#

2.2 MS-275对MCF7细胞的周期作用

0.5 µmol/L MS-275、1.0 µmol/L MS-275、1.5 µmol/L MS-275作用MCF7细胞24 h，与溶剂对照组相比较，0.5 µmol/L MS-275处理组细胞的周期无明显差异，随着MS-275作用浓度的逐步升高阻滞在G1期的细胞明显增加（P＜0.05），见图1。

图1 流式细胞仪检测不同浓度MS-275对MCF7细胞周期的影响

2.3 Western-blotting检测MS-275处理MCF7细胞P21，P27,CyclinD1、CDK4D的表达变化

图2 Western-blotting检测MS-275作用MCF7细胞后P21、P27、CyclinD1、CDK4D蛋白的表达量变化

0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7细胞24 h后，与溶剂对照组比较，0.5 μmol/L MS-275处理组细胞p21，p27，CCND1、CDK4D 蛋白的表达量无明显变化，1.0 μmol/L MS-275处理的细胞p21，p27,蛋白的表达量明显增加，且随着MS-275作用浓度的升高而升高（P＜0.05），CCND1、CDK4D蛋白的表达量明显减少，且随着MS-275作用浓度的升高而下降（P＜0.05），见图2。

3 讨 论

组蛋白去乙酰化酶抑制剂主要通过控制DNA缠绕在组蛋白的松紧程度来发挥作用，而组蛋白的乙酰化酶和去乙酰化酶主要是通过组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶来实现[1-2]。抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化、凋亡的途径失控进而导致细胞发生恶变。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化酶，选择性地恢复肿瘤抑制因子和其它抗癌基因的表达，增强调控细胞凋亡、分化相关蛋白的表达和稳定性，诱导细胞凋亡及分化，成为一类新型的抗肿瘤药物，研究热点。MS-275是苯甲酰氨类衍生物（Benzamidesderivative），最近新合成的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂[3-4]，已被证实对部分肿瘤有效应且已应用在临床实验中，它能选择抑制组蛋白去乙酰化，肿瘤细胞作用强，在人体内稳定性好毒副作用相对较小，且使高度酰基化的组蛋白聚集 ，也能通过微生物设计合成，实现抑制细胞分裂 ，间接地抑制血管生成因子的表达，帮助阻断对肿瘤的血液供应进而诱导肿瘤细胞分化凋亡。

本研究通过实验证实MS-275 可以抑制MCF7细胞生长，并使 MCF7细胞周期停滞于G0/G1期。并且表明0.5 μmol/L MS-275作用MCF7细胞对细胞生长无显著影响，抑制率无明显差异，1.0 μmol/L MS-275作用MCF7对抑制细胞生长周期效应显著且抑制率显著增加，表现出一定剂量相关性。p21 和p27是调控细胞周期至关重要的关键基因，位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，p21又称WAF1/CIP1，p27蛋白是CKI中的一种,在真核细胞的细胞周期调控中起着重要的作用,是一种广谱的周期蛋白依赖激酶抑制剂,主要通过抑制CDK的活性,来阻断细胞周期中G1、S期的转换,实现对细胞周期的负调控.同时, 被认为是细胞周期中G1期向前发展的抑制剂。介导了TGF诱导的细胞在G0/G1期的休眠且通过C端与PCNA相互作用，阻断PCNA活化DNA聚合酶的活性达到抑制DNA的合成进一步使细胞周期停滞，因而被认为是一种抑癌基因。p27基因还参与了细胞分化,器官发育大小、细胞凋亡等重要信号传导途径。研究已证实细胞周期进程受到一系列Cyclin D/cdk精密调控，而P21、P27又是这个进程中与Cyclin D/cdk形成紧密结合的关键基因。例如，P21结合了cdk就能抑制它的作用，抑制cdk导致的Rb磷酸化，CDK激酶是细胞周期调控中的重要因素，是细胞周期运行的引擎分子。目前发现，至少存在12种CDK激酶，即CDK1至DK12。主要生物学作用是使得细胞由分裂间期向分裂期转化，分裂间期时内部的转化并以复合物形式出现[5-9]，同时，P27也能与Cyclin D结合调控细胞的周期变化，其过量表达导致细胞增殖分化紊乱最终恶变，由于组织分化程度差异致使不同肿瘤中阳性检出率表现不同，在分化较差的肿瘤细胞中表达量较高。在本研究中我们发现 1.0 μmol/L 浓度的MS-275 对MCF7细胞有明显的抑制生长效应且具有量效关系，1.0 μmol/L浓度之上可显著阻滞MCF7细胞生长，增强乳腺癌之p21。

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Deacetylase inhibitor to breast cancer mitotic cycle function and molecularmechanism discussion

LI Wei-qian1,LIU Xia1,ZHANG Shou-cheng2
(1. Department of pathology the third affi liated hospital of xuzhou medical college, Jiangsu Xuzhou 221003,China; 2. Department of pathology peixian people’s hospital of xuzhou city,Jiangsu Xuzhou 221600,China)

Objective Study the deacetylase inhibitor MS-275 to the breast cancer MCF7 cell cycle function and the mechanism. Methos 0.5、1.0、1.5 μmol / L MS-275 affects the MCF7 cell 24 hours, observes different density MS-275 with MTT to the MCF7 cell's growth inhibitory action; flow cytometry examination cell growth and the cycle; Westernblotting examine MS-275 to the mammary gland cancer cell cycle related gene expression..Results1.0 μmol/L density MS-275 has the obvious growth inhibitory action to the MCF7 cell, and presents certain quantity effect relations, may induce the mammary gland cancer cell MCF7 mitotic cycle above the 1.0 μmol/L density to hinder obviously, may strengthen the p21, p27 gene obviously the expression, reduces CCND1, the CDK4D gene expression obviously.ConclusionCertain dosage’s MS-275 suppresses breast cancer MCF7 cell’s growth, may through regulate many mitotic cycle related gene induction mammary gland cancer cell mitotic cycle to hinder, the cell hinders occurrence and p21, p27 gene expression increase and CCND1, CDK4D gene expression reduced related.

Deacetylase inhibitor; Mitotic cycle; Gene expression; CDK4D;Breast cancer Cell

R735.1

A