PET无菌冷灌装生产线无菌验证的限量检测及菌群分析

PET无菌冷灌装生产线无菌验证的限量检测及菌群分析

本文主要就PET无菌冷灌装线的无菌验证过程中，相关要素（人员、环境、物料、包材）的初始染菌情况观察及验证过程中微生物挑战实验、水包测试、LG培养及测试、产品测试及灌装环境微生物水平确认等关键验证步骤中微生物操作要点分析。另外就阳性样品微生物分析思路及操作要点进行详细讲解。

一、无菌验证涉及到的微生物限量检验及菌群分析方法

1. 直接接菌法（固体培养基、液体培养基）

1.1 直接接种法：将测试样品品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。

1.2 培养结果的观察：各种微生物经过培养后，表现出一定特征，这在食品微生物学检验中，是鉴别微生物种类的重要依据。

1.3 不同培养基应用

（1）固体培养基上菌落形态特征的观察：主要应用于细菌数量判定

操作方法参照GB4789.2《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

细菌在固体培养基上，经过一定时间的培养，即可出现肉眼可见的菌落，每种细菌都有一定的菌落形态和特征，主要包括菌落的大小、形状、边缘形态、颜色、透明度等

观察菌落的形态特征，通常先用肉眼观察，再用放大镜仔细观察，必要时可用低倍镜观察。

（2）液体培养基中培养特征的观察：主要应用于无菌验证的LG培养基灌装验证

直接接种法：固体培养基、液体培养基

薄膜过滤法

划线涂布法

主要是液体的浑浊度是否产生沉淀，液体表面有无菌膜形成，有无附着菌环，培养液的颜色以及是否产气等。如果出现浑浊等变化，要接种不同的选择培养基进行菌群分析；或取培养液涂片，染色，镜检，判断菌种。

2. 薄膜过滤法

薄膜过滤法：含抗菌、抑菌成分的供试品会抑制某些微生物的生长繁殖，所以用常规方法检查会出现假阴性的结果，但并不等于产品中没有微生物甚至是致病性微生物。采用薄膜过滤法来去除供试品中可溶的抑菌性成分，把细菌等微生物截留在滤膜上，然后再经过处理培养使所含微生物生长繁殖，从而使微生物检出。

2.1 过程

水溶液供试品→取规定量的供试液，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。→供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000mL，以免滤膜上微生物受损伤。→冲洗后分别贴膜，培养。

2.2 膜过滤法的优点精确：膜过滤法可以检测微生物含量极低的大量样品。没有抑制剂的干扰：样品过滤后，可用合适的溶液将抑制剂冲洗掉。

检测固体样品：固体样品可以粉碎、预过滤后检测。

可永久保存检测结果：经过培养的滤膜可在干燥后，贴在报告纸上存档。

2.3 培养及观察

3. 平板划线分离法

由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

用途：一般多用于从菌种的纯化；优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；

4. 革兰氏染色镜检

4.1 原理：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；其细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色。强度较坚韧，厚度约20～80nm，肽聚糖层多，可达50层，呈三维结构，肽聚糖量多磷壁酸+，外膜-，脂多糖-，脂蛋白-，致病性菌多产生外毒素，对青霉素敏感。

染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。其的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。强度较疏松，较薄，5～10nm，肽聚糖层数少，1～3层，呈二维结构肽聚糖含量少，磷壁酸—，外膜+，脂蛋白+，脂多糖+，致病性多产生内毒素，药敏对链霉素等敏感。

4.2 操作方法

涂片、初染（结晶紫染色1min）、媒染（碘液媒染约1min）、脱色（95%的乙醇脱色）、复染（番红液复染约1～2min）水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸、镜检。

革兰氏染色镜检

生化鉴定（试剂盒法）

5. 生化鉴定（试剂盒法）

这里主要建议购置现成的试剂套盒。

二、关注要素

食品杀菌前被污染的菌数和杀菌效果有直接的关系。因此，减少食品杀菌前物料染菌量极为重要。

菌种、菌数与污染源及污染途径有关。所以，要对水和原料的原始带菌量，加工处理过程的合理性，及车间环境、个人卫生和工器具带来的二次污染等监控。

1. 与人员相关的卫生状况

与人员相关身体状况检查，手部微生物状况，更衣室、工作服等微生物状况监控。目的是保证无菌操作中最大程度降低人员的二次污染。主要是涂抹检查。

2. 水、原料及包材微生物水平：原始带菌量的检验目的

2.1 了解不同原辅料微生物菌群特性，以便于当发生污染时的原因分析。

产品消毒、灭菌前的细菌总数，可判明原辅料、包材受细菌污染的程度以及生产所涉及的工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是给合理制定杀菌工艺和无菌验证提供综合依据。保证杀菌的效果，不断完善生产工艺，监控杀菌过程的有效性。

2.2 防止原始带菌量过高影响最终产品微生物水平。2.3 根据原始带菌量确定杀菌及清洗消毒工艺。

3. 设备微生物水平

3.1 水处理系统：储存罐、管道及相应杀菌过滤等

3.2 杀菌前生产设备： 溶解罐、配料罐及管道

3.3 杀菌及灌装设备：UHT、杀菌后储存罐、管道及灌装，系统设备管道

3.4 包材输送：包材输送设备

方法：涂抹（较难清洗死角或不平整表面要重点关注）及冲洗最后一道流出水微生物检测；包材输送风道可以检测浮游菌。

4. 环境微生物水平

4.1 主要关注微生物实验室、生产车间净化间微生物水平。

4.2 监测方法：尘埃粒子数、浮游菌检测、沉降菌

空气检测难点：如何有效地采集气体中尽可能多的微生物，且不能影响到所采集的微生物生长。

5. 工艺过程微生物相关

5.1 不同加工阶段半成品微生物水平观察。

5.2 产品各成分不同配比：关注产品不同成分的比率，来确定杀菌及清洗消毒程序（不同产品程序肯定不能使一样的）。

5.3 UHT杀菌效率、消毒剂杀菌效率及不断改进提高

加热杀菌工艺条件制定的原则是：在保证食品的安全性的基础上，尽可能地将加热程度，在影响食品品质的最小限度内。

6. 微生物挑战试验、水包、LG及产品测试微生物操作要领

6.1 菌种选择。

6.2 菌数测定。

6.3 接种方法。

6.4 阳性对照

检测方法：直接接种法

三、菌群分析

1. 实验室误差防范

1.1 当符合下列至少

一个条件时，方可判试

验结果无效：

（1）微生物检验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；

（2）回顾微生物试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。

监测方法

（3）样品中生长的微生物经鉴定后，确证是因试验或采样中所使用的物品或操作技术不当引起的。

试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。

1.2 环境及人员要求

1.2.1 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。还应该具有高度的责任心和严谨细致的工作作风。

1.2.2 环境监测及空白试验

1.2.2.1 无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。

1.2.2.2 无菌试验过程中也应检查空气中的菌落数。

1.3 试验前准备

微生物挑战试验

1.3.1 器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃，30min，或置电热干燥箱内160℃，2h。

1.3.2 培养基：适应性和准确性检查。

1.3.2.1 适用性检查：无菌性检查，每批培养基随机不少于5个平板的培养，应无菌生长。

1.3.2.2 灵敏度检查

菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

★ 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B） 26 003］

★ 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B） 10 104］

★ 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B） 63 501］

★ 生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64 941]

★白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98 001]

★ 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]

环境及人员要求

1.4 被测样品防止二次污染

1.4.1 被测样品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的样品。进入无菌检验室的样品若有两层（或两层以上）包装的，需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入实验室。

1.4.2 检测过程：操作人员准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、鞋进入无菌室。

1.4.3 对照试验：

阴性对照：目的是验证试验是否存在污染；

阳性对照：目的是验证试验可靠性，防止假阴性。

实验前准备：器具灭菌、培养基

2. 污染菌数量级变化考察

2.1 主要是涉及无菌验证过程中水包和产品测试时发生微生物污染原因排查。

2.2 通过菌数变化来分析引起微生物污染的原因。

2.2.1 通过菌数变化来分析整个生产过程微生物污染的状况。

2.2.2 判明检品细菌污染的程度，以及生产所用的原料、工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是对产品进行综合判定。

3. 设备工艺控制微生物的能力

3.1 通过无菌验证前期的挑战试验来判定设备杀菌能力；温度贴条监测。

3.2 消毒剂杀菌试验（过氧乙酸优于其他消毒剂）。

3.3 无菌验证各种挑战试验情况。

3.4 LG培养基灌装验证整条生产线控制微生物能力培养基灌装失败调查。

3.4.1 实验室

★ 生产环境的监控数据评估：人员样、表面样、环境空气样；

★ 对培养基污染的评估：培养条件、对污染培养基的菌种必须进行鉴定、确定培养基污染可能发生的时间；

★ 对培养基评估：原水及RO水杀菌记录 、配制及杀菌记录、培养条件培养结果；

3.4.2 生产部

★ 杀菌的评估：UHT杀菌相关数据、料液暂存罐相关数据、管道密封性；

★ 灌装的评估：包材传送设备运行数据及微生物带菌状况、隔离罩内环境监测数据、灌装机运行相关数据；

★ 清洁和消毒评估：设备及灌装间清洗消毒相关数据、消毒剂供应商、配比及有效期、消毒剂实物确认；

★ 人员进出的评估：灌装间最多的人数、操作人员连续工作时间、其它人员；

★ 空调系统的维护记录。

高效过滤器泄漏测试（PAO测试）、空气平衡报告、压差记录、温湿度记录、粒子测试、报警记录。

★ 校验记录：重要设备上仪表的校验

3.4.3 培养基灌装失败处理

★ 确定原因：过程中引起、非过程中引起；

★ 采取行动：进行整改、重新验证、一批或三批。

4. 微生物污染特性分析

如果发污染，对污染菌丛进行初步鉴别是很有用的，某些菌种可表明特定污染平源。如果某些可能的污染来源可预先排除在外，就可节省进行系统检验的时间和费用。鉴别腐败菌的第一步是描述所观察到的产品腐败特征：pH值、气体的产生、凝聚现象、气味、分离现象。

第二步是分离鉴别引起腐败的微生物。

4.1 包括：耐热性检测、需氧性、厌氧性检测、多菌相还是单一菌相；

4.2 多菌相还是单一菌相：确定二次污染还是杀菌不良引起；4.3 耐热性检测：主要是确认是否与UHT杀菌有关；4.4 需氧性、厌氧性检测：确定生产管线及隔离罩的密封性；

4.5 产品状态：产酸产气、只产酸不产气、其他变化等等。

5. 污染菌种鉴定

选择性培养、革兰氏染色、生化鉴定。

6. 常见污染菌种及原因分析

6.1 耐热芽孢菌

在自然界分布极广，尤其常见于土壤和水中。细菌为杆状，有些很大，0.3～2.2×1.2～7.0μm，排列为单个、成对或短链状，G+，端生或周生鞭毛，运动或不运动，好氧或兼性厌氧，可形成芽孢。芽孢具有一定的对热的抵抗力，因此，是食品工业中经常出现的污染菌。

蜡样芽孢杆菌污染食品后，引起食品变质，尚可引起食物中毒。其在甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板的典型特征：蜡样芽孢杆菌显白色，其外围有粉红色的晕环。

★ 不发酵甘露醇：在甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板上生成微粉红色菌落；

★ 产生卵磷脂酶：分解MYP琼脂中的卵磷脂，在菌落周围产生粉红色混浊环（沉淀环）；

★ 产生酪蛋白酶：分解培养基中的酪蛋白，生成L-酪氨酸在菌落周围形成透明圈。

枯草芽孢杆菌常造成面包腐败。但它们产生蛋白酶的能力较强，经常作为蛋白酶的生产菌种。

多粘芽孢杆菌：多粘类芽孢杆菌对棉花、花生、玉米、水稻等多种植物具有防腐和促生的作用，已被美国环境保护署（EPA）列为可商业上应用的微生物种类之一。

6.2 常温菌群

6.2.1 乳酸菌，可造成产品酸包。

乳酸菌（Lectobacirrus）概念：乳酸菌是一类群能从可发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）主要产乳酸的细菌通称。

乳杆菌属（Lactobacillus）

①形态特征：细胞形态以杆状为主的多样形，有长形、细长状、棒形、弯曲形、短杆状、球杆状等。一般排列成链，通常不运动，部分有周身鞭毛，能运动。G+，无芽孢，有些菌株革兰氏染色呈两极性，内部有颗粒物或呈现出条纹状。 ②培养特性：微好氧性，在固体培养基上培养时，通常需厌氧条件或减少氧压、或充有5～10%的CO2，可增 加其表面生长物，有些菌株在初次分离时就需厌氧条件。 常用培养基：MRS琼脂。

③生长温度：2～53℃，最适温度30～40℃。耐酸，最适pH5.5～6.2。

6.2.2 醋酸杆菌属（Acetobacter）

醋酸杆菌的分布很普遍，一般从腐败的水果、蔬菜、果汁、变酸的酒类等食品中都能分离出醋酸杆菌。细菌细胞呈椭圆形杆状，G-，排列成单个或链状，不生芽孢，运动或不运动，需氧。本属菌具有很强的氧化能力，可将乙醇氧化成醋酸。

本菌有两种类型的鞭毛：① 一群为周身鞭毛，可将氧化生成的醋酸进一步氧化成H2O和CO2；② 另一群为极生鞭毛，不能进一步氧化醋酸。醋酸杆菌是制醋的生产菌株，另在日常生活中常常危害水果与蔬菜，使酒、果汁变酸。

6.2.3 肠道细菌

6.2.3.1 大肠杆菌，它们在产品生长可造成胀包；

污染菌种鉴定

蜡样芽孢杆菌

乳杆菌属

大肠杆菌（E. coli）大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌。

①形态特征：符合埃希氏杆菌属特征。

②培养特性：需氧或兼性厌氧，在普通琼脂培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，最适pH值7.2～7.4。生长24h后，形成的菌落为圆形、直径约2～3mm、近似灰白色、隆起、光滑、半透明、湿润、边缘整齐的菌落。

麦康凯琼脂培养基上培养18～24h后，形成红色菌落；伊红美兰琼脂培养成为黑色带有金属光泽菌落；远藤氏琼脂培养基为红色带金属光泽的菌落。

③生化特性：能发酵多种碳水化合物（葡、乳、麦、蔗、甘）产酸产气，绝大多数菌株能发酵乳糖，迟缓发酵或不发酵者仅为少数。约半数菌株能发酵蔗糖。硫化氢试验阴性，不分解尿素，V. P和柠檬酸试验阴性，MR和吲哚试验阳性。

6.2.3.2 大肠菌群

大肠菌群：是指一群在37℃下经24h能发酵乳糖、产酸产气、好氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

6.2.3.3 沙门氏菌属（Salmonella）

为G-短杆状，不产生芽孢和荚膜，周身鞭毛，能运动，兼性厌氧，最适温度为37℃，能分解葡萄糖产酸产气，不分解乳糖和蔗糖。

该菌为人类重要的肠道病原菌，可引起肠道传染病或食物中毒。 另外志贺氏杆菌（Shigella）的生物学特性及危害性与该菌基本相同。

6.2.4 不发酵革兰阴性杆菌，指一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌；多为条件致病菌。

分类：不发酵革兰阴性杆菌包括假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、不动杆菌属、莫拉菌属、金氏杆菌属、黄杆菌属、艾肯菌属、土壤杆菌属、黄单胞菌属、丛毛单胞菌属等。

6.2.4.1 假单胞菌属为需氧、有鞭毛、无芽胞、无荚膜的革兰阴性杆菌，氧化酶试验阳性，DNA G+C为58～71mol%，包括200余种菌。多数为腐生菌，少数为植物和动物寄生菌，大多为条件致病菌。假单胞菌属分布广泛，土壤、水和空气中均有存在，人类非发酵菌感染中，假单胞菌占70%～80%，主要有铜绿假单胞菌。

微生物特性：形态与染色：G-杆菌，多形性，有鞭毛、菌毛、荚膜，无芽孢，产荧光素和绿脓素专性需氧，4℃不生长42℃生长，在血平板上经35～37℃，18～24h培养可表现为：菌落大而扁平、湿润、边缘不齐，有金属光泽，有生姜样芳香气味，菌落周围有宽大的兰绿色透明溶血环。

醋酸杆菌属

大肠杆菌（大肠埃希氏菌）

沙门氏菌属

产碱杆菌属

铜绿假胞单杆菌

典型型（麦康凯平板）

★ 普通琼脂培养基上能产生水溶性绿色素，使整个培养基变为绿色。MAC培养基上，18～24h可形成微小无光泽半透明的菌落。SS平板上可行成类似沙门菌的菌落（中心黑色菌落）。

★ 分离培养：在普通培养基生长良好，经18（中心黑色菌落）24h形成圆形、扁平隆起、湿润菌落。琼脂被染成绿色或黄绿色，约80%（中心黑色菌落）90%产生绿脓素或荧光素。在血平板上表现为：菌落大而扁平、湿润、边缘不齐；有金属光泽；有生姜样芳香气味；菌落周围有宽大的兰绿色透明溶血环。

本菌在自然界分布很广。某些菌株具有很强的分解脂肪和蛋白质的能力，它们污染食品后，如果环境条件适宜，可在食品表面迅速生长，一般产生水溶性色素、氧化产物和粘液性物质，引起食品产生异味或变质。很多菌在低温下能很好生长，导致冷藏食品的腐败变质。例如，荧光假单胞菌，在低温下可引起肉、乳及乳制品的腐败。

6.2.4.2 产碱杆菌属（Alcaligenes）

分布极广，主要存在于水、土壤、饲料和人畜的肠道内，形态为杆状，G-，不能分解糖类产酸，能产生灰黄色、棕黄色或黄色色素。能使乳制品及其它动物性食品产生粘性而变质，并能在培养基上产碱。

6.2.4.3 明串珠菌属（Leuconostoc）

分布较广，常常在牛乳、蔬菜、水果上发现。菌体呈圆形或卵圆形，链状排列，G+。

肠膜明串珠菌能利用蔗糖合成大量荚膜物质——葡聚糖，已被用来生产右旋糖酐，可作为代血浆的主要成分。但是，明串珠菌常因污染食品后而造成麻烦，例如：牛乳的变粘，制糖工业中由于增加糖液的黏度，影响过滤，延长生产周期，降低产量。

6.2.4.4 葡萄球菌属

葡萄球菌广泛的分布于自然界中，如空气、饲料、饮水、地面及物体表面、人及畜禽的皮肤、黏膜、肠道、呼吸道及乳腺中也有寄生。

葡萄球菌为圆形的细胞，直径0.5（中心黑色菌落）1.5μm，G+，排列方式为单个、成对或葡萄串状，不形成芽孢和鞭毛，无运动性。某些葡萄球菌能形成荚膜或黏液层。细胞壁中含有肽聚糖和磷壁酸两种主要成分，还有蛋白质。由于菌株不同，磷壁酸可为甘油型或核糖醇型。

★ 分类传统的分类法按照葡萄球菌所产生的色素，共分为三种：金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；柠檬色葡萄球菌（Staphylococcus citreus）。

6.3 酵母菌及霉菌，抗热性霉菌及酵母菌

★ 常见的黄色丝衣霉菌，其抗热能力比其它霉菌强，85C 30分钟仍能存活，且能在氧气不足的环境牛存活并生长繁殖，具有强烈的破坏果胶质的作用，它能分解糖产生二氧化碳并造成产品胀包；

★ 其次是白色丝衣霉菌，也有抗热性，在76.6℃的温度下能生存30分钟，也可引起饮料的变质，可通过霉臭味、食品褪色或组织结构改变、内容物中有霉菌菌丝以及有时出现的轻度膨胀得到证实。

★ 酵母菌的抗热能力很低，除了杀菌不足或密封不良，通常是不会发生酵母菌污染的。

酵母菌

明串珠菌属

葡萄球菌属

抗热性霉菌