HPLC 法同时测定感冒止咳颗粒中绿原酸、葛根素和黄芩苷的含量

柴鑫莉，陈 蕾，舒金富（衢州市食品药品检验所，浙江衢州 324000）

感冒止咳颗粒是由柴胡、山银花、葛根、青蒿、连翘、黄芩、桔梗、苦杏仁提取物与薄荷脑制成的颗粒制剂[1]，具有解表清热、止咳化痰之功效，常用于外感风热所致的感冒发热、头痛鼻塞、伤风咳嗽、喉咙肿痛等。山银花、葛根和黄芩均为感冒止咳颗粒的主药，其有效成分分别为绿原酸、葛根素和黄芩苷。目前，关于感冒止咳颗粒成分的定性和定量分析的报道较多，但仅为单一的测定某一种成分，如测定绿原酸[2-4]、葛根素[5-7]、黄芩苷[8-9]、连翘苷[10-11]。为了更全面的保障感冒止咳颗粒的质量，在本研究中笔者采取多波长切换高效液相色谱（HPLC）法同时测定了感冒止咳颗粒中绿原酸、葛根素和黄芩苷的含量。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000 型HPLC 仪，包括真空在线脱气泵、LPG-3400SD 四元泵、WPS-3000 自动进样器、Tcc-3x00 柱温箱、VWD-3x00 紫外检测器、Chromeleon 7 工作站（美国thermo 公司）；Mettler FE20 Ph 计（瑞士梅特勒-托利多公司）；Mettler XP205十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 药品与试剂

绿原酸对照品、葛根素对照品、黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201314、110752-200209、110715-201117）；感冒止咳颗粒（A厂，批号：ZJ12008、ZJ12009、ZHB1303、ZJB1311；B厂，批号：131005；C厂，批号：1 312204；D厂，批号：20130901）；甲醇（色谱纯，美国Media 试剂公司）；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为ph2.6磷酸溶液，采用梯度洗脱（梯度洗脱见表1）；柱温：25 ℃；流速：0.8 ml/min；检测波长：327 nm（0～9 min），250 nm（9.1～15 min），280 nm（15.1～30 min）；进样量：10 μl。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution process

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、葛根素、黄芩苷对照品适量，置于不同的50 ml 量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度分别为0.468、0.196、0.390 mg/ml 的对照品贮备液。分别精密量取上述对照品贮备液各1.0、5.0、5.0 ml，置于同一25 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取感冒止咳颗粒适量，研细，精密称定粉末1 g，置于50 ml 棕色量瓶中，加入30%甲醇适量，称定质量，超声处理30 min（功率：250 W，频率：40 kHz），放冷，加入30%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm孔径微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液的制备 按处方中各药材的比例制备不含山银花、葛根和黄芩的阴性对照品，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密吸取“2.2”项下供试品溶液、混合对照品溶液、阴性溶液各10 μl，注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。在该色谱条件下，绿原酸、葛根素和黄芩苷均能达到基线分离，保留时间分别是7.44、11.24、21.97 min，理论板数按绿原酸计算不低于4 000。

图1 高效液相色谱图A.阴性溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.绿原酸；2.葛根素；3.黄芩苷Fig 1 HPLC chromatogramsA .negative solution；B.mixed control；C.test sample；1.chlorogenic acid；2.puerarin；3.baicalin

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下绿原酸对照品贮备液、葛根素对照品贮备液、黄芩苷对照品贮备液各适量，加水制成不同系列浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述溶液10 μl，注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以检测质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，回归方程及线性范围见表2。

表2 回归方程及线性范围Tab 2 Regression equation and linear range

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次。结果，绿原酸、葛根素、黄芩苷峰面积的RSD 分别为0.08%、0.06%、0.08%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：ZJ12008）适量，分别室温密闭放置0、2、4、6、8、10、12 h时，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定。结果，绿原酸、葛根素、黄芩苷峰面积的RSD分别为2.37%、0.10%、2.98%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取样品（批号：ZJ12008）适量，共6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定。结果，绿原酸、葛根素、黄芩苷峰面积的RSD 分别为1.11%、0.32%、3.41%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的样品（批号：ZJ12008），共9 份，分别取“2.2.1”项下绿原酸对照品贮备液0.8、1.0、1.2 ml，葛根素对照品贮备液3.0、4.0、5.0 ml，黄芩苷对照品贮备液2.5、3.0、3.5 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 样品含量测定

取7批感冒止咳颗粒样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定，计算3种成分的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab 4 Content determination of sample（mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

感冒止咳颗粒中绿原酸、黄芩苷在碱性条件下不稳定。有研究报道了绿原酸、葛根素和黄芩苷的检定方法[2-9]，分别比较了以乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-1.8%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-ph2.6 磷酸溶液、甲醇-1%醋酸溶液等为洗脱溶剂，同时比较了流速分别为0.8、1.0 ml/min，柱温分别为25、30 ℃时各成分的分离度。发现当流速为0.8 ml/min，柱温为25 ℃，流动相为甲醇-ph2.6 磷酸溶液，采用梯度洗脱时，各成分分离度均较好。

3.2 提取溶剂的选择

笔者通过比较乙醇、30%乙醇、70%乙醇、甲醇、30%甲醇、70%甲醇等不同溶剂对样品提取的效果，发现甲醇、30%甲醇、70%甲醇的提取效果均较好，但甲醇、70%甲醇均影响各成分的分离度及峰型，故选择30%甲醇为提取溶剂。

3.3 提取方法的选择

在本研究中笔者分别观察了超声提取、回流提取样品，结果表明两种提取方法测得的各成分含量均无明显差异，但超声提取更简便、快捷，故选择超声提取。同时又比较了超声提取15、30、45、60 min时各成分的含量，发现当超声提取30 min时各成分含量无明显变化，故选择超声提取30 min。

3.4 检测波长的选择

笔者分别对绿原酸、葛根素、黄芩苷进行全波长扫描，发现绿原酸、葛根素、黄芩苷的最大吸收波长分别在327、250、280 nm处。如在同一波长下检测将损失某些成分的检测灵敏度，故选择多波长切换HPLC 法，分别在各成分最大紫外吸收波长处进行检测，使各成分在相应波长下有最大吸收。

3.5 样品含量测定结果

本研究对4 个厂家7 批感冒止咳颗粒进行测定，绿原酸、葛根素、黄芩苷的含量在0.289～1.045、0.578～2.064、2.073～3.027 mg/g 范围内，相同厂家不同批次间的含量值较接近，不同厂家之间含量差距较大，可能与不同厂家的原料来源和制备工艺不同的有关。

综上所述，本方法简便、快速、重复性好，可用于感冒止咳颗粒的质量控制。

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