酵母菌葡萄糖耐量因子的纯化

孔凡华，刘 鹭，张书文，芦 晶，李红娟，薛海晓，赵丽丽，周志江,*，吕加平,*

（1.天津大学化工学院，天津 300072；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

酵母菌葡萄糖耐量因子的纯化

孔凡华1，刘 鹭2，张书文2，芦 晶2，李红娟2，薛海晓2，赵丽丽2，周志江1,*，吕加平2,*

（1.天津大学化工学院，天津 300072；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

以高铬酵母菌粉为研究对象，采用温和的纯化方法，通过氨水提取高铬酵母菌粉中的酵母菌葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF），联用SuperdexTM75和Sephadex G25凝胶过滤层析对提取物进行粗分离，然后用反相高效液相色谱对提取物进行再分离，从而对GTF进行高效纯化研究。将GTF纯化品作用于胰岛素抵抗型3T3-L1脂肪细胞，通过检测细胞葡萄糖消耗量，分析GTF纯化品对细胞葡萄糖代谢调节活性。研究表明，GTF纯化品可以有效提高胰岛素抵抗型3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的消耗。可见，经过多步柱层析纯化后，可以得到具有葡萄糖代谢调节活性的GTF纯化品 。

酵母菌葡萄糖耐量因子；高铬酵母粉；纯化；胰岛素抵抗型3T3-L1脂肪细胞；葡萄糖代谢

近年来，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率迅速增长。糖尿病患者体内微量元素铬含量明显低于健康人[1-3]，临床研究表明，补铬对治疗不同类型的糖尿病（Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和类固醇引起的糖尿病等) 均有效[4-7]。酵母菌葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）是一种高活性的铬补充物，它是小分子的铬结合物质，三价有机铬是其重要活性中心，含有半胱氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸[8]，GTF能提高胰岛素的活性，促进胰岛素与细胞膜受体结合，利于机体组织对葡萄糖的吸收[9]。脂肪组织是胰岛素的重要外周靶器官，在胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病的发病中起重要作用[10]。

国内外许多研究者对GTF分离纯化工作进行了研究，Davies等[11]使用DEAE-cellulose分离纯化酵母氨水提取物，结果显示阴、阳组分皆有 GTF 活性及铬。Edens等[12]利用C18反相层析和离子对反相高效液相色谱对酵母提取物进行纯化研究，得到3 个结构组分复杂的分离物。Liu lu[13-14]和Vincent[15]等通过凝胶过滤层析和高效液相色谱对酵母氨水提取物进行分步分离，得到m/z比值分别为712.253 5和769.274 7的铬结合物，但没有对铬结合物进行活性分析。尽管从酵母中纯化GTF的研究工作已经有近60 年的历史，研究者采用不同的分离方法纯化出一些铬络合物，但到目前为止，仍没有纯化出GTF纯品，GTF的结构没有得到完全解析，并且由于纯化条件的苛刻（用强酸提取或强极性树脂分离）[16-17]，可能导致纯化后的GTF失去生物活性。本实验在前人研究的基础上尝试通过温和的纯化方法：氨水提取[18]、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对酵母菌葡萄糖耐量因子进行纯化研究，以3T3-L1胰岛素抵抗型脂肪细胞[19]为评价模型，观察GTF对脂肪细胞葡萄糖消耗的影响，分析其对细胞葡萄糖代谢调节活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3T3-L1前脂肪细胞株，购自中国协和医科大学细胞库。

地塞米松、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰岛素 美国Sigma公司；高糖DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、胎牛血清 美国Corning公司；胰蛋白酶 美国Gibco公司；SuperdexTM75和Sephadex G25美国GE公司；铬标准液（1 000 µg/mL） 中国计量科学院；硝酸、高氯酸均为优级纯；三氯化铬、氨水、葡萄糖等均为国产分析纯；酵母浸粉、大豆蛋白胨、琼脂粉为生化试剂；分析用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

CXG常压生物电脑层析系统 上海沪西分析仪器厂；UV2300分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；MDS-6微波消解/萃取仪 上海新仪微波化学科技有限公司；SIGMA 3K-15离心机 美国Sigma公司；AA6300火焰原子吸收分光光度计 日本岛津公司；DL-CJ-IN高性能无菌试验台 哈尔滨市东联公司；TSAO HSINTH-3560高压灭菌锅 造鑫企业有限公司；YP2001N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；HZQ-F160摇床培养箱 哈尔滨市东联公司；BIOTECH-50BG自动控制发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；RE52-99旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Virtis Genesis冷冻干燥机 美国Virtis公司；1525 Binary HPLC系统 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌葡萄糖耐量因子的粗提

通过50 L发酵罐发酵工艺制备高铬酵母菌体[20]，冷冻干燥得高铬酵母菌粉。氨水提取菌粉中有机铬[18]，旋转蒸发浓缩处理后，冷冻干燥备用。

1.3.2 SuperdexTM75凝胶过滤层析条件

去离子水溶解高铬酵母菌粉氨水提取物，离心后上规格为1.6 cm×60 cm的SuperdexTM75凝胶过滤层析柱，以50 mmol/L醋酸氨和0.15 mol/L氯化钠（pH 6.0）混合液作为洗脱液，洗脱流速为0.3 mL/min，每10 min收集一管洗脱液，共收集60管，用紫外分光光度计在254 nm波长处对各管洗脱液进行检测，微波消解，参照GB/T 15555.6—1995《固体废物 总铬的测定 直接吸入火焰原子吸收分光光度法》测定洗脱液中的铬含量，收集第2个铬峰洗脱液，冷冻干燥备用。

1.3.3 Sephadex G25凝胶过滤层析条件

去离子水溶解冷冻干燥的SuperdexTM75凝胶过滤层析第2个铬峰洗脱液，过膜后上规格为1.6 cm×80 cm的Sephadex G25 凝胶过滤层析柱，以去离子水为洗脱液，洗脱流速为0.3 mL/min，每10 min收集一管洗脱液，共收集70 管，用紫外分光光度计在254 nm波长处对各管洗脱液进行检测，微波消解，测定洗脱液中铬含量，收集铬峰，冷冻干燥备用。

1.3.4 反相高效液相色谱条件

去离子水溶解冷冻干燥的Sephadex G25凝胶过滤层析铬峰洗脱液，进一步用反相高效液相色谱制备性层析柱纯化，色谱柱为XBridgeTMC18色谱柱（10 mm×250 mm，10 μm），流动相A液，乙腈-三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）体积比1 000∶0.8，B液，水-TFA体积比1 000∶1。采用梯度洗脱的方法，洗脱15 min，乙腈20%～22%，洗脱流速为1.5 mL/min，每30 s收集一管洗脱液，共收集30 管，在254 nm波长处对每管洗脱液进行检测，微波消解，测定洗脱液中铬含量。收集铬峰，继续用反相高效液相色谱制备性层析柱分离，采用梯度洗脱的方法，洗脱12 min，乙腈60%～100%，洗脱流速为2 mL/min，每30 s收集1 管洗脱液，共收集24 管，在254 nm波长处对每管洗脱液进行检测，微波消解，测定洗脱液中铬含量。

1.3.5 GTF对胰岛素抵抗型3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响

3T3-L1前脂肪细胞接种于24 孔培养板，待细胞汇合后接触抑制48 h，换用含10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松培养基培养48 h，然后换用含10 mg/L胰岛素培养基培养48 h，继续用DMEM高糖培养基培养[21]，每2 d换液1 次，培养8～12 d，前脂肪细胞可分化为成熟脂肪细胞。将成熟脂肪细胞用10-7mmol/L胰岛素诱导处理48 h使其成为胰岛素抵抗型细胞[19,22]。用纯化后的GTF作用抵抗型细胞，通过加或不加胰岛素（10-7mmol/L）共同作用24 h，以铬添加量反映GTF添加量，观察GTF对细胞葡萄糖消耗的影响。

2 结果与分析

2.1 SuperdexTM75凝胶过滤层析结果

254 nm是GTF的特征吸收波长，铬是GTF的活性中心，因此本实验采用同时检测254 nm波长处吸光度和铬含量来分析GTF的分布。由图1可知，高铬酵母粉氨水提取物经SuperdexTM75凝胶过滤层析后，得到3 个A254nm峰，2 个铬峰。酵母氨水提取物中组分比较复杂，一些杂质也会在A254nm波长时有较大吸光度，因此根据铬峰判断洗脱液中GTF的分布更有指导意义。根据凝胶层析分离原理，大分子物质先于小分子物质洗脱出来，故第1个铬峰为大分子铬蛋白，第2个铬峰为小分子铬蛋白。尽管目前为止还没有 GTF分子质量的确切报道，但国内外学者对酵母提取物分离纯化研究结果均表明[8,13,15,23]，GTF 为小分子物质，因此可以判断，第2个铬峰为实验目标物，因此收集第2个铬峰洗脱液，冷冻干燥备用。

图1 SuperdexTM75凝胶过滤层析Fig.1 Purif i cation with SuperdexTM75 gel chromatographic

2.2 Sephadex G25凝胶过滤层析结果

图2 Sephadex G25凝胶过滤层析Fig.2 Purif i cation with Sephadex G25 gel chromatography

收集SuperdexTM75第2个铬峰洗脱液，过Sephadex G25凝胶过滤层析柱，得到5 个A254nm峰，1 个铬峰。其中铬峰与第2个A254nm峰吻合。可见通过SuperdexTM75和Sephadex G25凝胶过滤层析，可以去除大量杂蛋白，GTF得到初步纯化。在此基础上，本实验继续用RP-HPLC对铬峰进行纯化，以分析其纯度，并对铬峰高效率分离。

2.3 RP-HPLC第1次纯化

图3 RP-HPLC第1次纯化Fig.3 First purif i cation by RP-HPLC

由图3可知，经反相高效液相分离后得到3 个A254nm峰，1 个铬峰，铬峰和第1个A254nm峰重合。可见C18柱对GTF进行了有效分离，去除了与GTF分子质量相近的蛋白组分，对GTF的进一步分离起到很好的纯化效果。

2.4 RP-HPLC第2次分离纯化

图4 RP-HPLC第2次纯化Fig.4 Second purif i cation by RP-HPLC

为分析RP-HPLC对GTF的纯化效果及所得铬峰的纯度，收集第1次RP-HPLC铬峰洗脱液，继续用RP-HPLC进一步纯化，如图4所示，在整个洗脱过程中，只出现一个A254nm峰和一个铬峰，两峰重合且对称分布。综上所述，通过联用SuperdexTM75、Sephadex G25凝胶过滤层析和反相高效液相色谱纯化，可以得到GTF纯品。

2.5 GTF对胰岛素抵抗型3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响

图5 GTF对胰岛素抵抗型3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响Fig.5 Effect of GTF on glucose consumption of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

文献报道GTF能提高胰岛素的活性功能，促进胰岛素与细胞膜受体结合，协同胰岛素一起参与人体糖和脂质代谢[9-10]。3T3-L1脂肪细胞是功能性评价中典型的模式细胞。本实验通过胰岛素和高糖培养基培养方法，诱导3T3-L1脂肪细胞成为胰岛素抵抗细胞模型，模拟Ⅱ型糖尿病环境，以研究葡萄糖耐量因子对体外脂肪细胞葡萄糖代谢的影响。如图5所示，对胰岛素抵抗型细胞，单独加GTF时，随着GTF添加量的增加，细胞葡萄糖消耗量呈一定的递增趋势，这可能是由于GTF通过p38 MAPK途径促进了细胞葡萄糖的消耗[24]。当GTF与胰岛素共同作用于细胞时，细胞葡萄糖消耗量显著增加，呈剂量依赖效应，当细胞培养液中铬质量浓度为1 µg/mL时，细胞葡萄糖消耗量可以提高2.5 倍，可见，分离纯化得到的GTF纯品，具有显著调节葡萄糖代谢的活性。

3 结 论

本实验用氨水提取高铬酵母菌粉中葡萄糖耐量因子，通过SuperdexTM75、Sephadex G25凝胶过滤层析和反相高效液相色谱对其进行纯化，得到GTF纯品。通过胰岛素抵抗型3T3-L1脂肪细胞评价纯化所得GTF对细胞葡萄糖代谢的调节作用，结果表明：在胰岛素存在时，GTF可以显著提高细胞葡萄糖消耗量，且呈剂量依赖效应。可见，通过联用SuperdexTM75和Sephadex G25凝胶过滤层析和反相高效液相色谱，可以对GTF进行有效分离，纯化所得GTF样品具有显著葡萄糖代谢调节活性。

[1] 刘丹阳. 铬在糖尿病防治中的作用[J]. 中国医药指南, 2013, 11(9): 448-449.

[2] CEFALU W T, HU F B. Role of chromium in human health and in diabetes[J]. Diabetes Care, 2004, 27(11): 2741-2751.

[3] ZAFRA-STONE S, BAGCHI M, PREUSS H G, et al. The nutritional biochemistry of chromium[M]. Postlethwaite: Elsevier Science Ltd., 2007: 183-206.

[4] SHINDEA U A, SHARMA G, XU Y J. Insulin sensitisingaction of chromium picolinate in various experimental models of diabetes mellitus[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2004, 18(1): 23-32.

[5] RAVIAN A, SLEZAK L, RUBLA A, et al. Clinical use of the trace element chromium (Ⅲ) in the treatment of diabetes mellitus[J]. Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 1995, 8(3): 183-190.

[6] JOVANOVIC L, GUITIERREZ M, PETEQSON C M. Chromium supplementation for women with gestational diabetes mellitus[J]. Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 1999, 12(2): 91-97.

[7] VLADEVA S V, TERZIEVA D D, ARABADJ I D T. Effect of chromium on the insulin resistance in patientswith typeⅡdiabetes mellitus[J]. Folia Medica, 2005, 47(3/4): 59-62.

[8] TOEPFER E W, MERTZ W, POLANSKY M M, et al. Preparation of chromium-containing material of glucose tolerance factor activity from brewer’s yeast extracts and by synthesis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1976, 25(1): 162-166.

[9] 施咏梅, 陈著隽. 微营养素对糖尿病的防治作用[J]. 中华临床营养杂志, 2011, 19(3): 204-207.

[10] VINCENT J B. Chromium: celebrating 50 years as an essential element?[J]. Dalton Transactions, 2010, 39(16): 3787-3794.

[11] DAVIES D M, HOLDSWORTH E S, SHERRIFF J L. The isolation of glucose tolerance factors from brewer’s yeast and their relationship to chromium[J]. Biochmeical Medicine, 1985, 33: 297-311.

[12] EDENS N K, REAVES L A, BERGANA M S, et al. Yeast extract stimulates glucose metabolism and inhibits lipolysis in rat adipocytes in vitro[J]. Journal of Nutrition, 2002, 132(6): 1141-1148.

[13] LIU Lu, LÜ Jiaping, ULUKO H. Purif i cation and characterization of chromium-binding substances from high-chromium yeast[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(6): 1279-1287.

[14] LIU Lu, KONG Fanhua, ZHANG Shuwen, et al. Response to comment on purification and characterization of chromium-binding substance from high-chromium yeast[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(38): 9282-9284.

[15] VINCENT J B. Comment on purification and characterization of chromium-binding substances from high-chromium yeast[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(38): 9280-9281.

[16] HAYLOCK S J, BUCKLEY P D, BLACKWELL L F. Separation of biologically active chromium-containing complexes from yeast extracts and other sources of glucose tolerance factor (GTF) activity[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 1983, 18(3): 195-211.

[17] O’DONOGHUE E M, COOPER J A, JACKSON T G, et al. Identif i cation of peptides from autolysates of Saccharomyces cerevisiae that exhibit glucose tolerance factor activity in a yeast assay[J]. The International Journal of Biochemistry, 1990, 22(8) : 841-846.

[18] 刘鹭, 吕加平, 高艳红. 酵母源性葡萄糖耐量因子(GTF)含量测定方法的研究[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(1): 140-144.

[19] 刘晓华, 江湖, 李海星, 等. 胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立[J]. 食品科学, 2012, 33(19): 249-253.

[20] 高艳红, 吕加平, 赵丽芹, 等. 酵母源葡萄糖耐量因子 (GTF) 生产技术的研究进展[J]. 粮油加工, 2009(2): 107-110.

[21] BARNES D M, KIRCHER E A. Effects of mercuric chloride on glucose transport in 3T3-L1 adipocytes[J]. Toxicology in Vitro, 2005, 19(2): 207-214.

[22] 陈立, 杨明炜, 库宝庆, 等. 三种不同方法诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的对比研究[J]. 中国全科医学, 2012, 15(9): 999-1001.

[23] VINCENT J B. Mechanisms of chromium action: low-molecularweight chromium-binding substance[J]. Journal of the American College of Nutrition, 1999, 18: 6-12.

[24] WANG Yiqun, YAO Minghui. Effects of chromium picolinate on glucose uptake in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes involve activation of p38 MAPK[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2009, 20(12): 982-991.

Purif i cation of Glucose Tolerance Factor (GTF) from High-Chromium Yeast

KONG Fan-hua1, LIU Lu2, ZHANG Shu-wen2, LU Jing2, LI Hong-juan2, XUE Hai-xiao2, ZHAO Li-li2, ZHOU Zhi-jiang1,*, LÜ Jia-ping2,*
(1. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

In this study, a mild extraction procedure was used to purify glucose tolerance factor (GTF) from high-chromium yeast cells. GTF was extracted by ammonia from high-chromium yeast cells. SuperdexTM75 and Sephadex G25 gel fi ltration chromatography were adopted to purify the extracts. Reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used for further purif i cation. The glucose metabolism regulating activity of GTF was evaluated in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. This research showed that through multiple steps of column chromatography, the pure GTF was obtained, which could improve glucose metabolism in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes.

yeast glucose tolerance factor; high-chromium yeast; purif i cation; insulin-resistant 3T3-L1adipocytes; glucose metabolism

Q939.99

A

1002-6630（2014）21-0001-04

10.7506/spkx1002-6630-201421001

2013-12-05

国家自然科学基金面上项目（31371763）

孔凡华（1989—），女，硕士研究生，主要从事食品微生物研究。E-mail：kkfanhua@126.com

*通信作者：周志江（1960—），男，教授，博士，主要从事食品安全与食品生物技术研究。E-mail：zzj@tju.edu.cn吕加平（1963—），男，研究员，博士，主要从事食品微生物与发酵工程研究。E-mail：lvjp586@vip.sina.com