心房颤动的全基因组关联研究进展

李延健(综述)，佘 强(审校)

(重庆医科大学附属第二医院心内科，重庆 400010)

心房颤动(房颤)是临床上十分常见的疾病，至今已报道了大量明确的致病危险因素，包括高龄、男性、高血压、糖尿病、心力衰竭、心肌梗死、心肌病[1-2]，说明房颤是一个多因素疾病。基因背景在房颤的发病中起重要作用，早期的基于候选基因病例-对照的试验研究发现了很多与房颤关联的单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，但是这些试验参与人群数量较少且没有进一步的大规模的重复试验，故说服力较差。近年来报道了许多应用全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)发现的房颤易患基因位点，这些位点与房颤的关联性也更加真实可信；这些易患位点也对认识房颤的发病机制提供了很多有用的线索。

1 房颤GWAS

1.1易患区域4q25 2007年Gudbjartsson等[3]第一次应用GWAS研究房颤。该研究从冰岛人群中筛选出550例房颤(或心房扑动)患者和4476例对照者，用Illumina Hap300 BeadChip基因芯片测序，最终在4q25区域发现了两个与房颤强关联的突变位点，即rs2200733和rs2220464。二次重复试验在冰岛人群(2251例房颤患者和13 238例对照者)以及两个具有欧洲血统的人群(分别为来自瑞典的143例房颤患者和738例对照者以及美国的636例房颤患者和804例对照者)中进行，亦证实了这种强关联性。最后，他们将该位点在中国人群(333例房颤患者和2836例对照者)进行重复试验也得到相同的结论。

此后，Kääb等[4]联合来自欧洲和美国的4个队列：Framingham Heart Study(FHS)、Rotterdam Study(RS)、Vanderbilt AF Registry、German Competence Network for Atrial Fibrillation(AFNet)共计3508例房颤患者和12 173例对照者进行上述位点与房颤的病例-对照关联试验，发现rs2200733在4个队列人群中均与房颤存在强关联性，但是rs10033464只是在FHS和AFNet队列中证实与房颤关联。有趣的是，无论是在Gudbjartsson等[3]还是Kääb等[4]的研究中，与房颤最强关联的位点rs2200733似乎在年龄更小的患者中具有更强的效应值[4]。Viviani Anselmi等[5]则在意大利人群(78例房颤或心房扑动患者和348例对照者)中证实了rs2200733 T等位基因与房颤的强关联性。Lee等[6]对中国台湾人群筛选了200例房颤患者和158例对照者，应用多重单碱基延伸的方法对5个SNPs，分别为rs2634043,rs2200733,rs13143308,rs2220427,rs10033464进行基因分型，他们也证实了rs2200733与房颤的关联，但是否定了rs10033464与房颤的关联。总之，这些研究都一致显示rs2200733与房颤的强关联性，而rs10033464则在不同的人群中有不同的结果。2009年，Shi等[7]在中国汉族人群中应用病例-对照的方法研究rs2200733与房颤的关联性，也得出了阳性关联结论，当他们把房颤组进一步分为孤立性房颤和其他类型房颤单独分析时发现，rs2200733与孤立性房颤的关联较其他类型房颤更强，这可能暗示遗传对孤立性房颤较其他类型房颤作用更强。

2010年Lubitz等[8]从美国马萨诸塞州综合医院筛选了790例房颤患者和1177例对照者，在4q25区域选取了34个SNPs进行基因分型并检验它们与房颤的关联。在这一区域他们鉴定出了两个新的与房颤关联的突变位点，即rs17570669和rs3853445。随后将这两个新鉴定的位点放在来自German Competence Network for AF(AFNET),Atherosclerosis Risk in Communities Study(ARIC),Cleveland Clinic Lone AF Study(CCAF),Cardiovascular Health Study(CHS)和Rotterdam Study(RS)5个队列共计5066例房颤患者和30 661例对照者中进行房颤的关联研究，结果均为阳性关联。然而,他们研究中的受试者都是欧洲人群，这两个SNPs与房颤的关联能否在其他人种中得到证实仍不得而知。

到目前为止还没有一个已知基因是定位在包含了前面所述的突变位点的连锁不平衡区域，位于上游毗邻的连锁不平衡区域的Pitx2是最靠近这些突变位点的一个基因[3]。研究证实,Pitx2基因在自左心房肌延伸形成的肺静脉肌袖的增殖分化过程中起着至关重要的作用,而来自肺静脉的触发活动对于房颤的开始和维持起着决定性作用，提示Pitx2可能在房颤的发生中发挥着重要作用[9]。另外，有研究显示Pitx2在心房肌表达不足会导致左心房和右心房的同等程度的扩大[10]，并且会导致骨形态发生蛋白10在左心房表达上调[11]，而骨形态发生蛋白10的过度表达在调节生理性肥大方面有重要作用[12]。因此，这就支持一种假说：骨形态发生蛋白10在心房肌组织选择性的上调是由Pitx2介导的，并进一步导致了细胞增殖和心房腔扩大。而心房扩大已经被认可是房颤发生和维持的重要机制。最近，有报道称Pitx2c在持续性房颤患者的心房组织表达降低[13]。但是,至今仍无直接证据显示Pitx2c在人类心肌组织表达降低,是由于房颤相关联的这些突变位点所致。

1.2易患区域16q22 继发现与房颤相关的突变区域4q25后，2009年Gudbjartsson等[14]再次在冰岛人群中应用GWAS发现了新的与房颤强相关的突变位点，即位于16q22的rs7193343，但是在中国人群进行重复试验时没有达到应有的统计效力。随后Benjamin等[15]纳入了来自Age,Gene/Environment Susceptibility Reykjavik Study (AGES),Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC),Cardiovascular Health Study(CHS),Framingham Heart Study(FHS)和Rotterdam Study(RS)5个队列(共计896例持续房颤患者和15 768例对照以及2517例阵发房颤患者和21 337例对照者)进行GWAS的Meta分析，发现位于16q22的rs2106261与房颤关联。随后他们将这一关联在一个来自德国的队列人群(145例房颤患者和4073例对照者)进行了成功的重复验证。Li等[16]尝试在中国人群重复这两个突变位点与房颤的关联，他们选取了650例房颤患者和1447例对照者，研究证实了rs2106261与房颤的关联，但是rs7193343关联没有达到统计学意义。

16q22区域的突变位点处于ZFHX3基因内，而ZFHX3基因对神经细胞和骨骼肌细胞的分化及增殖发挥重要作用[14-15]。ZFHX3编码的转录因子AT motif-binding factor 1(Atbf1)对Pituitary-specific positive transcription factor 1(POU1F1)早期的转录活性有重要影响[14-15]。而研究发现POU1F1可与Pitx2相互作用[15-16]，Pitx2与房颤的关系在前文已经述及，所以ZFHX3是否通过这一途径导致房颤易患,需要进一步的实验证据。

1.3易患区域1q21 孤立性房颤患者在没有非遗传患病风险因素时仍然发生房颤，那么这些患者肯定具有与常人不同的相关遗传背景。基于这种观点Ellinor等[17]纳入了来自German Atrial Fibrillation Network(AFNET),Heart and Vascular Health Study(HVH),Atherosclerosis Risk in Communities Study(ARIC),Cleveland Clinic以及Massachusetts General Hospital Atrial Fibrillation study(MGH)的共计1335例早发孤立性房颤患者和12 844例对照者进行GWAS的Meta分析研究,结果鉴定出了一个全新的位于1q21的房颤易患位点，即rs13376333。随后他们在来自德国(977例房颤患者和3042例对照者)和美国(187例房颤患者和565例对照者)的两个人群中进行该位点与孤立性房颤的关联研究，结果证实为阳性关联。而Li等[16]在中国人群的重复试验显示，该位点与房颤的关联未达到统计意义。

与房颤关联的1q21区域中发现的最强关联位点rs13376333定位在KCNN3的第一内含子[17]。KCNN3编码钙依赖性钾离子通道SKCa2.3，这些通道对于可兴奋组织至关重要。据报道它们已经在脑[18]和心脏表达[19-20]。KCNN家族在心脏的作用并不十分清楚。在兔短阵超速起搏实验中发现SKCa通道阻滞剂可通过缩短肺静脉和心房动作电位时程而抑制超速起搏刺激诱发异位肺静脉局灶点冲动，使起源于肺静脉的激动易于传向左心房肌而形成折返导致房颤发生和维持[21]。但是，在短阵超速起搏实验中并没有检测到KCNN3表达量的变化，而另一个钙离子依赖性钾离子通道家族成员KCNN2却显示出了表达量增加[21]。KCNN2和KCNN3在体内可聚合为多亚基通道复合物[22]，这种多亚基通道复合物意义重大，因为当KCNN2被异位的表达于小鼠时，它会抑制KCNN3的表达，起搏细胞的动作电位时程和自主节律都会被改变[23]。但是，至今也没有直接的证据显示这一突变位点可以导致人类心脏组织KCNN3表达的减少。

1.4其他易患区域 2012年，Ellinor等[24]联合多个欧洲人群(6707例房颤患者和52 426例对照者)应用GWAS的Meta分析的方法发现了6个新的易患位点,并且在一个独立的欧洲人群(5381例房颤患者和10 030例对照者)进行重复试验证实了阳性关联。这些易患位点分别是1q24的rs3903239、7q31的rs3807989、9q22的rs10821415、10q22的rs10824026、14q23的rs1152591、15q24的rs7164883，与之相应的候选基因则分别是PRRX1,CAV1,C9orf3,SYNPO2L,SYNE2,HCN4。这些基因大多与心脏起搏、离子通道以及心肺发育相关，并进而与房颤的发生机制产生联系[25-28]。但这些SNPs是否会影响到邻近基因的转录表达，尚需后续试验证实。此外，这些位点除欧洲人群外尚无更多人群的重复试验，这也需要后续多人群的重复试验进一步验证。

2 房颤SNPs的临床应用

GWAS发现的这些与房颤相关的突变位点为人们理解房颤的分子机制提供了新的线索，并且在某些应用领域也显示出巨大的潜能，如房颤患病风险预测、预后评估、对抗心律失常治疗的反应评估等[29]。

脑卒中是房颤最重要的并发症之一。Gretarsdottir等[30]运用基因芯片Infinium Human Hap300 chip对来自冰岛的1661例脑卒中患者和10 815例健康对照者进行基因分型，研究发现rs2200733和rs10033464与缺血性脑卒中具有显著相关性，具有心源性卒中最强的危险度。随后他们将这一结果在共计含2224例缺血性脑卒中患者和2583例健康对照者的两个大型的欧洲缺血性脑卒中组试验中得以验证。然而，Lemmens等[31]进行了一项大型的病例-对照关联研究，研究选取了6组分别来自澳大利亚、奥地利、比利时、波兰、西班牙和瑞典的队列共计4299例缺血性脑卒中患者和3750例对照者，他们认为rs2200733和rs10033464与脑卒中的关联仅局限于心源性脑卒中患者。随着基因测序技术的进步及成本大幅度降低，今后病因不明的脑卒中患者是否应接受基因测序检查？这就取决于未来更大量人群以及不同种族人群的深入的关联研究结果[31]。

房颤是心脏手术后最常见的并发症，据估计其发病率为27%～40%[32]。Body等[32]在两个独立的心脏手术组进行研究发现，位于4q25区域的rs2200733和rs13143308能够预测冠状动脉旁路移植术后房颤的发生，但是rs10033464与术后房颤没有明确的关联。并且他们的研究显示,冠状动脉旁路移植术后的房颤风险预测可能因联合多个基因位点而得以改善预测效能。最近，Virani等[33]在来自TexGen genetic registry的1166例高加索房颤患者中发现，rs2200733和rs10033464位点都与冠状动脉旁路移植术后房颤相关(OR=1.41,1.47)。他们也发现这两个位点与长时程房颤相联系，风险比分别为1.32和1.28。基于上述两项研究结果推断，应用4q25的两个突变位点既能预测冠状动脉旁路移植术后短期房颤也能预测长时程房颤风险。据此，医师可以调整术后治疗，提前筛选出术后高发房颤风险的患者并加强监护、早期识别并治疗。Husser等[34]入选了195例因药物抵抗的阵发性或持续性房颤而行射频消融治疗的患者，他们对这些患者进行了为期6个月的随访，发现rs2200733和rs10033464位点的任何突变的等位基因都会增加房颤早期复发(OR=1.994)和晚期复发(OR=4.182)的风险。Benjamin Shoemaker等[35]也对来自Vanderbilt AF Registry的378例房颤射频消融术患者进行随访观察，证实了rs2200733可以独立的预测术后房颤的复发。他们的研究表明,利用这些突变位点可在房颤患者行射频消融治疗前对患者进行分层。也可被用在手术前预测风险或成功率，并制订手术策略以及相应的术后管理。

3 房颤丢失的遗传度

尽管来自房颤的GWAS结果鼓舞人心，但是有关房颤的很大一部分遗传度仍未能被解释。一种可能是房颤丢失的遗传度存在于未知数量的尚未被鉴定的突变位点内；第二种可能是房颤丢失的遗传度存在于罕见的突变位点，而这些位点还没有完全的被目前的GWAS覆盖。现在人们已经注意到突变位点的频率与效应值呈负相关；罕见的突变位点往往含有较大的效应值，而常见的突变位点只有较温和的效应值[36]。为了找到更多的与房颤相关联的遗传位点，最直接的方式就是增加受试者数量，如在研究QT间期的GWAS试验中，一个包含了200例患者的队列只定位到NOS1AP基因附近的一个突变位点[37]，而在两个独立的随访试验中(分别包括13 685和15 842例患者)，有10个不同的易患位点被定位出来[38-39]。这些具有较小的效应值的突变位点只有在更大的标本数量时才能被检测出来。虽然只有有限的效应值，但这些基因突变位点也能够提供有用的与房颤相关的分子机制线索。

4 房颤GWAS的后续研究

未来的研究工作会放在更大规模的GWAS以发现更多相关突变位点。此外，有研究显示在同一区域联合多个房颤易患位点较单个易患位点预测房颤的患病风险效应值明显增加[9]。所以,最后的结果可能是需要更多的而不是少数的突变位点来最终解释房颤的遗传度。未来继续在4q25和其他与房颤相关的GWAS区域测序可能有助于发现更多的与房颤相关的突变位点，并且还可能发现与功能改变相关的突变而不仅只是一些SNPs遗传路标。以后房颤的GWAS也需要更多种族人群的参与。到目前为止，所有房颤的GWAS都是在欧洲人群进行的。非洲和亚洲人群是否也会得到相同的结果仍不得而知。联合来自多种族人群的信息是一个有效发现与疾病相关联的SNPs方法。另外，在鉴定了与房颤相关的突变位点后，未来大量的研究则需要阐明后续的功能学机制。很快研究的焦点将会由统计遗传学转向立足于实验室的研究。这些研究包括整合并表达已经鉴定的SNPs到细胞系，设置剔除已知基因的动物模型，以及研究突变通道蛋白的电生理学方面的变化。结合新一代的基因分型和作图技术以及功能学的研究最终会阐明与房颤相关的SNPs导致房颤易患的机制，以及这些SNPs能有效预测临床预后和治疗效果的真正原因。

5 小 结

应用GWAS，目前已经发现4q25、16q22、1q21等多个染色体区域的多个SNPs与房颤的易患性相关。部分SNPs可对房颤发病、并发脑卒中、复律治疗效果作出有效预测。另外，这些SNPs也为实验室研究进一步揭示房颤发病的分子机制提供了有益线索。后续研究需要继续采用大样本并纳入多种族人群以增加检验的效力和说服力。

[1] Benjamin EJ,Levy D,Vaziri SM,etal.Independent risk factors for atrial fibrillation in a population-based cohort.The Framingham Heart Study[J].JAMA,1994,271(11):840-844.

[2] Krahn AD,Manfreda J,Tate RB,etal.The natural history of atrial fibrillation:incidence,risk factors,and prognosis in the Manitoba Follow-Up Study[J].Am J Med,1995,98(5):476-484.

[3] Gudbjartsson DF,Arnar DO,Helgadottir A,etal.Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25[J].Nature,2007,448(7151):353-357.

[4] Kääb S,Darbar D,van Noord C,etal.Large scale replication and meta-analysis of variants on chromosome 4q25 associated with atrial fibrillation[J].Eur Heart J,2009,30(7):813-819.

[5] Viviani Anselmi C,Novelli V,Roncarati R,etal.Association of rs2200733 at 4q25 with atrial flutter/fibrillation diseases in an Italian population[J].Heart,2008,94(11):1394-1396.

[6] Lee KT,Yeh HY,Tung CP,etal.Association of RS2200733 but not RS10033464 on 4q25 with atrial fibrillation based on the recessive model in a Taiwanese population[J].Cardiology,2010,116(3):151-156.

[7] Shi L,Li C,Wang C,etal.Assessment of association of rs2200733 on chromosome 4q25 with atrial fibrillation and ischemic stroke in a Chinese Han population[J].Hum Genet,2009,126(6):843-849.

[8] Lubitz SA,Sinner MF,Lunetta KL,etal.Independent susceptibility markers for atrial fibrillation on chromosome 4q25[J].Circulation,2010,122(10):976-984.

[9] Sinner MF,Ellinor PT,Meitinger T,etal.Genome-wide association studies of atrial fibrillation:past,present,and future[J].Cardiovasc Res,2011,89(4):701-709.

[10] Lozano-Velasco E,Chinchilla A,Martínez-Fernández S,etal.Pitx2c modulates cardiac-specific transcription factors networks in differentiating cardiomyocytes from murine embryonic stem cells[J].Cells Tissues Organs,2011,194(5):349-362.

[11] Tessari A,Pietrobon M,Notte A,etal.Myocardial Pitx2 differentially regulates the left atrial identity and ventricular asymmetric remodeling programs[J].Circ Res,2008,102(7):813-822.

[12] Chen H,Yong W,Ren S,etal.Overexpression of bone morphogenetic protein 10 in myocardium disrupts cardiac postnatal hypertrophic growth[J].J Biol Chem,2006,281(37):27481-27491.

[13] Kirchhof P,Kahr PC,Kaese S,etal.PITX2c Is expressed in the adult left atrium,and reducing Pitx2c expression promotes atrial fibrillation inducibility and complex changes in gene expression[J].Circ Cardiovasc Genet,2011,4(2):123-133.

[14] Gudbjartsson DF,Holm H,Gretarsdottir S,etal.A sequence variant in ZFHX3 on 16q22 associates with atrial fibrillation and ischemic stroke[J].Nat Genet,2009,41(8):876-878.

[15] Benjamin EJ,Rice KM,Arking DE,etal.Variants in ZFHX3 are associated with atrial fibrillation in individuals of European ancestry[J].Nat Genet,2009,41(8):879-881.

[16] Li C,Wang F,Yang Y,etal.Significant association of SNP rs2106261 in the ZFHX3 gene with atrial fibrillation in a Chinese Han GeneID population[J].Hum Genet,2011,129(3):239-246.

[17] Ellinor PT,Lunetta KL,Glazer NL,etal.Common variants in KCNN3 are associated with lone atrial fibrillation[J].Nat Genet,2010,42(3):240-244.

[18] Köhler M,Hirschberg B,Bond CT,etal.Small-conductance,calcium-activated potassium channels from mammalian brain[J].Science,1996,273(5282):709-1714.

[19] Tuteja D,Xu D,Timofeyev V,etal.Differential expression of small-conductance Ca2+-activated K+channels SK1,SK2,and SK3 in mouse atrial and ventricular myocytes[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(6):H2714-H2723.

[20] Xu Y,Tuteja D,Zhang Z,etal.Molecular identification and functional roles of a Ca2+-activated K+channel in human and mouse hearts[J].J Biol Chem,2003,278(49):49085-49094.

[21] Ozgen N,Dun W,Sosunov EA,etal.Early electrical remodeling in rabbit pulmonary vein results from trafficking of intracellular SK2 channels to membrane sites[J].Cardiovasc Res,2007,75(4):758-769.

[22] Monaghan AS,Benton DC,Bahia PK,etal.The SK3 subunit of small conductance Ca2+-activated K+channels interacts with both SK1 and SK2 subunits in a heterologous expression system[J].J Biol Chem,2004,279(2):1003-1009.

[23] Zhang Q,Timofeyev V,Lu L,etal.Functional roles of a Ca2+-activated K+channel in atrioventricular nodes[J].Circ Res,2008,102(4):465-471.

[24] Ellinor PT,Lunetta KL,Albert CM,etal.Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation[J].Nat Genet,2012,44(6):670-675.

[25] Ihida-Stansbury K,McKean DM,Gebb SA,etal.Paired-related homeobox gene Prx1 is required for pulmonary vascular development[J].Circ Res,2004,94(11):1507-1514.

[26] Koschak A.Impact of gating modulation in CaV1.3 L-type calcium channels[J].Channels,2010,4(6):523-525.

[27] Zhang Q,Bethmann C,Worth NF,etal.Nesprin-1 and-2 are involved in the pathogenesis of Emery Dreifuss muscular dystrophy and are critical for nuclear envelope integrity[J].Hum Mol Genet,2007,16(23):2816-2833.

[28] Nof E,Antzelevitch C,Glikson M.The Contribution of HCN4 to normal sinus node function in humans and animal models[J].Pacing Clin Electrophysiol,2010,33(1):100-106.

[29] Xiao J,Liang D,Chen YH.The genetics of atrial fibrillation:from the bench to the beside[J].Annu Rev Genomics Hum Genet,2011,12:73-96.

[30] Gretarsdottir S,Thorleifsson G,Manolescu A,etal.Risk variants for atrial fibrillation on chromosome 4q25 associate with ischemic stroke[J].Ann Neurol,2008,64(4):402-409.

[31] Lemmens R,Buysschaert I,Geelen V,etal.The association of the 4q25 susceptibility variant for atrial fibrillation with stroke is limited to stroke of cardioembolic etiology[J].Stroke,2010,41(9):1850-1857.

[32] Body SC,Collard CD,Shernan SK,etal.Variation in the 4q25 chromosomal locus predicts atrial fibrillation after coronary artery bypass graft surgery[J].Circ Cardiovasc Genet,2009,2(5):499-506.

[33] Virani SS,Brautbar A,Lee W，etal.Usefulness of single nucleotide polymorphism in chromosome 4q25 to predict in-hospital and long-term development of atrial fibrillation and survival in patients undergoing coronary artery bypass grafting[J].Am J Cardiol,2011,107(10):1504-1509.

[34] Husser D,Adams V,Piorkowski C.Chromosome 4q25 variants and atrial fibrillation recurrence after catheter ablation[J].J Am Coll Cardiol,2010,55(8):747-753.

[35] Benjamin Shoemaker M,Muhammad R,Parvez B,etal.Common Atrial Fibrillation risk alleles at 4q25 predict recurrence after catheter-based atrial fibrillation ablation[J].Heart Rhythm,2013,10(3):394-400.

[36] Wagner MJ.Rare-variant genome-wide association studies:a new frontier in genetic analysis of complex traits[J].Pharmacogenomics，2013,14(4):413-424.

[37] Arking DE,Pfeufer A,Post W,etal.A common genetic variant in the NOS1 regulator NOS1AP modulates cardiac repolarization[J].Nat Genet,2006,38(6):644-651.

[38] Newton-Cheh C,Eijgelsheim M,Rice KM,etal.Common variants at ten loci influence QT interval duration in the QTGEN Study[J].Nat Genet,2009,41(4):399-406.

[39] Pfeufer A,Sanna S,Arking DE,etal.Common variants at ten loci modulate the QT interval duration in the QTSCD Study[J].Nat Genet,2009,41(4):407-414.