滨州市奶山羊临床型乳房炎病原菌的分离鉴定与耐药性分析

郑风英

（滨州职业学院医疗学院，山东滨州256600）

羊乳房炎是乳腺腺泡或间质炎症的总称，是奶山羊最常见的疾病之一，病因复杂，主要与环境卫生条件及细菌入侵有关。表现为乳房红肿、质硬、拒绝哺乳和挤奶等临床乳房炎症状。导致奶山羊产奶量降低，乳汁质量下降，造成养羊业巨大经济损失，并且影响到人类的健康。近年来，滨州市周边地区的奶山羊养殖业发展迅速，已成为鲁北地区养羊业的3大交易基地之一，但是由于养羊和疾病预防知识宣传不到位，饲养及管理水平低，防控技术落后，使此病成为当地奶山羊最常见的疾病之一。本研究对滨州市5个中型奶山羊养殖基地和6个养殖集中村的临床型乳房炎病羊采集乳汁检测病原菌，旨在对本地区养羊业的健康发展和有效防控乳房炎提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 奶样 对奶山羊养殖基地和养殖集中村中已表现出明显临床症状且7d内未曾使用抗生素治疗的乳房炎病羊进行乳样采集，共采集29份。采集前用温水洗净乳头后用1mL/L苯扎溴铵及750mL/L酒精按无菌操作要求消毒处理，收集第3把奶5mL放入无菌试管，排序标记，并于3h内送至微生物实验室分离鉴定。

1.1.2 培养基与试剂 生化试剂及培养基均购于青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 药敏纸片与质控菌株 标准菌株由滨州兽医研究所提供。药敏纸片由上海金穗生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养与纯化 将乳样摇匀，无菌操作挑取2环～4环乳样，接种培养基，恒温培养18h～24h后，根据菌落的颜色、大小、透明度及溶血现象挑取典型菌落制片，革兰染色镜检。根据细菌的形态、排列方式及染色性初步判定细菌菌属。以同样方法对标准菌株进行培养，作为对照。连续培养3d无细菌生长则可报告无细菌生长。

1.2.2 细菌的生化鉴定

1.2.2.1 葡萄球菌生化鉴定 根据菌落性状、色素、溶血及染色情况取疑似菌落做生化试验，看触酶、CAMP因子等产生情况，进一步鉴定无乳链球菌、乳房链球菌及肠球菌。

1.2.2.2 链球菌生化鉴定 根据菌落性状、色素、溶血及染色情况取疑似菌落做触酶试验、CAMP试验、杆菌肽试验、七叶苷水解试验、PYR试验、65g/L NaCl耐盐试验做进一步鉴定无乳链球菌、乳房链球菌以及肠球菌的鉴定。

1.2.2.3 大肠埃希菌生化鉴定 在SS琼脂平板、麦康凯琼脂平板上挑取革兰染色为阴性短杆菌、菌落较大、湿润、隆起、边缘整齐的红色菌落分别接种KIA培养基、葡萄糖蛋白胨水、MIU培养基等培养基上，恒温培养18h～24h后观察结果。

1.2.2.4 变形杆菌生化鉴定 在SS琼脂平板上挑取革兰染色为阴性，呈多形性、菌落较大、湿润、隆起、边缘整齐、中心变黑菌落或在普通琼脂平板上呈迁徙生长的菌落接种KIA培养基、葡萄糖蛋白胨水、MIU培养基等培养基上，37℃培养18h～24h后观察结果。

1.2.2.5 药敏试验 分别依据 K-B法［1］标准的操作规程，取18h～24h纯化培养的各种细菌，稀释为0.5麦氏标准的菌悬液，相当于1.5×108cfu/mL。用无菌棉棒蘸取菌悬液15min内涂布完成。链球菌需使用MH血琼脂平板涂布细菌，涂布方法与上相同，贴好药敏片，置37℃培养18h～24h记录结果。以同样方法对标准菌株做药敏试验，用作质控菌株。

2 结果

2.1 细菌的分离培养及染色结果

培养出4类菌落：①Ⅰ类菌在普通琼脂平板上产生金黄色或白色脂溶性色素，中等大小，表面光滑、不透明、圆形凸起的菌落，在血琼脂平板上有β溶血或γ溶血现象。革兰染色镜检为葡萄串状排列的革兰阳性球菌；②Ⅱ类菌在普通琼脂平板上生长，在血琼脂平板上形成灰白色光滑小菌落，有溶血现象。革兰染色镜检呈链状排列，革兰阳性球菌；③Ⅲ类菌在普通琼脂平板上为湿润大菌落，在选择培养基为红色大菌落。革兰染色为革兰阴性小杆菌；④Ⅳ类菌在普通琼脂平板上生长良好，呈迁徙状生长，部分菌株在血琼脂平板上有溶血环，在SS平板及MAC培养基上形成无色、半透明的大菌落，在SS平板上，菌落中心成黑色。革兰染色镜检为多形性、呈革兰阴性。

2.2 生化鉴定

通过菌落特点、革兰染色、生化鉴定及查阅《伯杰系统细菌学手册》［2，8-15］确定分离菌共47株，Ⅰ类菌落分别为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；Ⅱ类菌落分别为肠球菌属细菌、无乳链球菌（B群链球菌）、乳房链球菌（D群链球菌）；Ⅲ类菌落为大肠埃希菌；Ⅳ类菌落为变形杆菌。生化反应测定结果见表1、表2和表3。

表1 Ⅰ类菌生化鉴定结果Table 1 The biochemical identification results of classⅠbacteria

表2 Ⅱ类菌生化鉴定结果Table 2 The biochemical identification results of classⅡbacteria

表3 Ⅲ类菌生化鉴定结果Table 3 The biochemical identification results of classⅢbacteria

检出的47株病原菌中金黄色葡萄球菌16株占34%；表皮葡萄球菌14株，占29.8%；无乳链球菌6株占12.8%；乳房链球菌2株占4.3%；肠球菌2株，占4.3%；大肠埃希菌6株占12.8%；变形杆菌1株占2.1%。

2.3 药敏试验结果

药敏试验显示，肠球菌对青霉素及头孢类抗生素耐药，葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、变形杆菌对头孢唑啉、头孢曲松、头孢西丁、阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦敏感，对青霉素、复方新诺明耐药（表4）。

表4 药敏试验结果Table 4 Results of drug sensitivity test

3 讨论

3.1 细菌的分离培养及鉴定情况分析

29份奶山羊临床型乳房炎乳样中检出7种47株病原菌。其中金黄色葡萄球菌16株，占34%；表皮葡萄球菌14株，占29.8%；无乳链球菌6株，占12.8%；乳房链球菌2株，占4.3%；肠球菌2株，占4.3%；大肠埃希菌6株，占12.8%；变形杆菌1株，占2.1%。鉴定结果显示，临床型乳房炎主要由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌和大肠埃希菌引起，每份乳样均分离到两种以上细菌。病原菌的分离情况与姚运亮等［3］、殷波等［4］、高娃等［5］、刘珍等［15］报道不一致，可能与下列因素有关：①目前，对奶山羊临床型乳房炎病原菌及药敏试验报道较少，虽然奶山羊和奶牛同属于家畜，但在喂养方式及环境上有一定区别，感染细菌类型可能有一定差别；②大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌、肠球菌、变形杆菌广泛存在于自然界中，是条件致病菌，当细菌数量增加、环境卫生差、饲料及水源污染细菌可引起感染；③由于采集标本时正值夏天，温度较高，适于细菌生长，更容易发生乳房炎；④挤奶程序不规范及挤奶工具不洁净可引起感染。因此，要定期到养羊基地和农村养殖集中村开展卫生知识宣传，介绍临床乳房炎临床表现，完善饲料管理，改善喂养环境，定期检测，使养殖户及养羊基地专业人员能及时识别，积极预防和处理，规范挤奶程序，减少乳房炎的发生；定期注射乳房炎疫苗可有效预防乳房炎，减少乳房炎的发生。

3.2 药敏试验结果分析

药敏试验结果显示，肠球菌对青霉素类及头孢类天然耐药，与其天然耐药有关，其余6种分离菌对不同药物的敏感性差异较大，结果分析表明，大肠埃希菌、变形杆菌对头孢唑啉、头孢曲松敏感率分别为75%～100%、92.9%～100%，与杨锐［6］、刘朝［7］的研究结果基本一致；分离菌对万古霉素、环丙沙星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、丁胺卡那霉素、阿米卡星和红霉素敏感。高度敏感药物可作为该地区奶山羊临床型乳腺炎的临床首选治疗药物。葡萄球菌对青霉素均耐药，其他分离菌也表现对青霉素和复方新诺明不同程度耐药，可能与临床广泛用药有关，致使细菌产生β-内酰胺酶，通过质粒在细菌间传递，造成耐药菌不断增加。因此，治疗临床型乳腺炎时，根据药敏结果科学、合理地使用抗菌药物。

［1］中华人民共和国卫生部.WS/T125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准［S］.北京：中国标准出版社，1999.

［2］中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译.北京：伯杰细菌鉴定手册［M］.8版.北京：科学出版社，1984.

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