“纳米细菌”与牙周病

王斯玮 综述;杨 岚，刘建国 审校

(贵州遵义563000:1.遵义医学院口腔医学院;2.遵义医学院附属口腔医院修复科;3.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室)

牙周病是一种慢性感染性疾病，其发病机制复杂。目前已证实，牙菌斑生物膜的细菌及其产物是引发牙周病的始发因素。牙菌斑生物膜是牙齿表面的微生物菌落，主要由细菌及聚合物基质组成，并可矿化形成牙石成为牙周病重要的局部促进因素。牙石不仅妨碍口腔卫生的实施，其表面的多孔隙结构还有利于细菌毒素的吸附，从而为菌斑生物膜的进一步聚集提供理想的表面;并可对牙龈组织产生一定刺激。目前尽管对牙石的化学成分有所了解，但对于其矿化机制尚不明确。近年来，有学者在肾脏、动脉粥样硬化斑块、卵巢肿瘤的沙粒小体、钙化胎盘、唾液、龈沟液、髓石、牙石及牙菌斑中均发现了一种超微结构的矿化颗粒，由于该物质具有独特的性质将其命名为“纳米细菌”(Nanobacteria，NB)。然而，关于“纳米细菌”的生物学行为仍存在争议，有学者认为，“纳米细菌”缺少可信的核酸证据，而是由矿物质离子和非矿化大分子化合物组成，因此将其命名为纳米矿化颗粒(Calcifying Nanoparticles，CNPs)更为恰当。本文就“纳米细菌”的研究现状及其与牙周病之间的关系作一综述。

1 “纳米细菌”概述

1.1 “纳米细菌”的发现及特征

20世纪80年代Kajander等在进行哺乳动物体外细胞培养时发现了一种超微结构的细菌，革兰氏染色为阴性，无荚膜及鞭毛，呈球状或球杆状，可通过微孔直径0.1～0.4 μm的滤菌膜;进一步检测发现，该细菌含有16sRNA基因序列，故将其归属于α-2蛋白质菌属(该菌属还包括巴尔通氏菌和布鲁氏菌);又由于其直径低于理论细菌的下限(约20～500 nm)，因此又将其命名为“纳米细菌”［1］。“纳米细菌”生长缓慢，倍增时间约为3 d，在pH 7.4的生理性钙磷浓度环境中能形成羟基磷灰石碳酸盐结晶并产生坚硬矿化外壳;同时，该菌还具有一定的细胞毒性，可引起细胞的溶解和凋亡［2］。

1.2 “纳米细菌”的致病性及其机制

1.2.1 “纳米细菌”可引起细胞内外矿化

多项研究表明:“纳米细菌”可引起细胞内外矿化，并作为成核核心引起钙化病变，可能是导致结石等多种病理性钙化疾病的重要原因。“纳米细菌”所产生的坚硬矿化外壳具有很强的抵抗力，高温、强酸等不能将之杀灭，普通抗生素也需在高于正常临床剂量下才对其有抑制作用，普通培养基和常规检测方法均难以对其进行培养及检测［3］。用能量色散X射线光谱仪(EDX)对“纳米细菌”的矿化外壳进行分析显示，其化学成分与羟基磷灰石相似［4］。Kajander等首先在肾结石中发现“纳米细菌”，并根据科赫法则验证了“纳米细菌”在过饱和溶液中可作为成核核心引起肾结石［5-6］。有学者在冠心病等心血管疾病的研究中发现，“纳米细菌”可通过多种途径进入血液循环，并能附着于血管壁缓慢生长;且可通过其异常的钙化能力使血液中钙离子浓度升高，从而导致动脉斑块和血栓的形成［7］。另有研究发现，胆结石中也存在“纳米细菌”，并利用“纳米细菌”成功建立了胆结石动物模型［8-9］。此外，在钙化胎盘、卵巢肿瘤的沙粒小体、牙石、髓石中均有“纳米细菌”检出的相关报道［10-13］。

1.2.2 “纳米细菌”的细胞毒作用

“纳米细菌”的另一个特点是具一定的细胞毒作用，可引起细胞的溶解和凋亡。Ciftcioglu等利用MTT分析法及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验证明，“纳米细菌”能感染人及哺乳动物的3T6成纤维细胞并使之溶解和凋亡，其机制主要是通过受体介导的内吞胞作用导致细胞空泡性变，在此过程中“纳米细菌”可诱导宿主产生大量的炎性介质(如白细胞介素、热休克蛋白、基质金属蛋白酶等)，从而导致被感染组织的细胞死亡［2］。Kajander等［14］认为，“纳米细菌”作为致炎因子能通过其细胞毒作用损伤肾小管的上皮细胞，受损的组织再生后则可导致多囊肾的形成。有研究者在13例多囊肾患者的囊液中检测到超过75%含有脂多糖(LPS)的成分，约有85%的患者检测出“纳米细菌”，其中男性检出率高于女性;同时还发现，“纳米细菌”与多囊肾中抗衣原体抗体LPS及巴尔通氏菌存在交叉反应，四环素或柠檬酸盐可抑制该细菌的生长［15］。Shen等在3型前列腺炎动物模型实验中发现:大鼠注射“纳米细菌”后1～2周发生了急性炎症，4周后转为慢性;分别在建模1、4、8周注射“纳米细菌”2周后，各实验组大鼠血清中的 IL-1β和TNF-α水平均高于对照组［16］。Tsurumoto［17］、石庆新等［18］在类风湿性关节炎患者的血清中也检测到了“纳米细菌”［17-18］。

1.3 关于“纳米细菌”的争议

“纳米细菌”的发现及其独特的特性虽为病理性钙化相关疾病的研究提供了新的思路，但仍存在一定的意见分歧。学者们通过一系列实验对“纳米细菌”的生物学行为进行研究后认为:磷脂可以结合并促进钙磷酸盐晶体的形成，所形成的晶体不仅具有与“纳米细菌”相似的形态学结构，还能象活生物那样在体外进行复制并增殖;而“纳米细菌”不仅体积太小难以界定为理论上的细菌，而且从“纳米细菌”中所检测出的核酸序列实际是来自实验室的污染［19-20］。因此“纳米细菌”是否能界定为细菌受到了极大的质疑。

一种新的观点认为，所谓“纳米细菌”是由矿物质离子和非矿化大分子化合物组成，尚无足够的证据证明其是一种独立的生命体。首先，无生命活性的生物大分子所形成的纳米粒子在结构和形态学上都与“纳米细菌”相似;其次，无生命活性生物大分子对带电荷的分子如离子、碳水化合物、脂类、核酸等也具有很强的结合力，当矿物质离子过饱和时即可形成结晶、钙化颗粒或更为复杂的结构［21-23］。另外，经检测发现，矿物质离子与非矿化大分子复合物中的蛋白主要是胎球蛋白A，其次是载脂蛋白、白蛋白等;免疫印迹法检测显示，针对“纳米细菌”的特异性抗体与血清中的白蛋白、胎球蛋白A等均存在交叉反应［24-26］。

根据以上观点和相关研究结果，有学者认为“纳米细菌”并非生物体，只是一种蛋白—矿物复合物，因为从主动脉瓣和股动脉瓣钙化斑块、牙结石中分离培养的“纳米细菌”并未检测出16sRNA序列［12，27-28］。最先提出“纳米细菌”概念的 Kajander、Ciftcioglu等也表示，由于缺乏满意的16sRNA序列，将其命名为钙化纳米颗粒更为恰当;但纳米矿化颗粒与病理性钙化之间的关系仍需进行深入研究和探讨［7，29-30］。Jahnen-Dechent等报道，在肾结石中也可检测到胎球蛋白，从而认为胎球蛋白A可能作为病理性钙化的抑制剂而具有监管作用，该物质的缺乏与人和鼠软组织钙化密切相关［26］。Hamano等通过对73位糖尿病及慢性肾脏疾病患者的胎球蛋白矿物质复合物进行检测发现后也认为，胎球蛋白A与骨外病理性钙化相关［31］。Alexander等研究发现，纳米矿化颗粒可作为成核核心形成簇集状结构，其形态学结构上与头部、子宫肿瘤的图像具有相似性［32］。

2 “纳米细菌”与牙周病及其他口腔疾病的关系

2.1 “纳米细菌”与牙周病相关性

“纳米细菌”与牙周病之间的相关性提出主要基于几个方面:①流行病学调查发现“纳米细菌”的检出率和牙石的患病率均为男性高于女性［33］;②盐酸四环素及乙二胺四乙酸(EDTA)可抑制“纳米细菌”的复制，而这些药物用于牙周病治疗业已多年［3］;③开发的含二磷酸钠、磷酸二钠、氯磷酸二钠、硝酸稼、乙二胺四乙酸的抗“纳米细菌”牙膏、漱口水对牙石的形成及牙周病均有预防效果［34］。

Zhang等认为，来自血清的龈沟液可能存在“纳米细菌”，而且牙石形成所需的碱性环境及钙化过程与“纳米细菌”相似，进一步研究发现:在牙周病患者的牙石和龈沟液中均提取出“纳米细菌”，其表面相关物质为钙、磷酸盐，与牙石类似;“纳米细菌”通过受体介导的细胞毒作用可导致细胞空泡性变、细胞凋亡，并能诱导磷脂酰丝氨酸作为“纳米细菌”及其他大分子的结合位点，从而引起更多的“纳米细菌”聚集以及细胞外基质的矿化［12］。张松梅、黄小庆等也报道，在慢性牙周炎患者的龈沟液和牙石中均检测出“纳米细菌”［35-36］。以上结果提示，“纳米细菌”能在牙表面形成生物矿化中心，并与其周围的钙及磷酸盐结合而形成牙石。

此外，口腔是一个与外界交通、多种菌群混合居住的复杂环境，且含有丰富的血管，因此全身性疾病与口腔之间易通过血液循环发生交叉感染。已有文献报道，牙周病和冠心病存在相关性［37］，而且在冠心病患者的相关样本中也可检测到“纳米细菌”，那么“纳米细菌”是否在两者之间具有桥梁作用，值得进一步探讨［38］。

2.2 “纳米细菌”与口腔其他疾病的关系

Badry等报道，在复发性唾液腺结石中可检测到“纳米细菌”［39］。曾劲峰等从髓石中分离培养、鉴定出“纳米细菌”，并认为该物质对牙髓细胞有细胞毒性，这种阶段性病理性钙化标志物可为髓石的防治、提高根管治疗疗效提供新的切入点［40］。临床研究发现，龋病的流行在有牙石的患者中显著低于无牙石患者，据此有理论认为:“纳米细菌”可能参与龋坏牙釉质的修复过程，可矿化缺损的牙体组织;因此须权衡“纳米细菌”形成牙石导致牙周病及其在牙釉质修复、龋病预防之间的利弊［41］。另有学者还提出，“纳米细菌”可悬浮在云层中，并通过空气传播途径引起全球范围的口腔病理性钙化疾病(牙石，髓石，唾液腺等)的流行［41-42］。

3 小结

近年来，关于“纳米细菌”的研究已受到愈来愈多学者的关注，但其是否能界定为生物及其引起病理性钙化的机制仍需进一步研究，可通过加大样本量、动物实验、免疫机制研究等多种手段来揭示“纳米细菌”的特性;针对其特殊的理化性质，还可在检测方法上寻找新的更为准确快速的方法对其进行鉴定。而有关“纳米细菌”与口腔疾病，特别是牙周病的关系，目前研究尚少，仍需更多的证据证明“纳米细菌”牙菌斑、唾液、龈沟液、髓石中的存在及其作用原理。如果“纳米细菌”作为牙周病病因学能被确立，那么对牙周病乃至心血管疾病的防治将有重要意义。

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