牙龈卟啉单胞菌牙龈素研究进展

毛骁俊 综述;唐子圣 审校

(上海200011:1.上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔医学院;2.上海交通大学医学院附属第九人民医院牙体牙髓科，上海市口腔医学重点实验室)

牙龈素是牙龈卟啉单胞菌最重要的毒力因子之一，在介导细菌与宿主相互作用中起着重要的作用［1-2］。随着对牙龈素结构及其基因多态性研究的逐步深入，人们发现牙龈素对于牙龈卟啉单胞菌的毒力有重要影响，从而推动了牙龈素相关抑制剂的研究进展。本文结合近年来的相关研究进展，就牙龈素的分子结构、基因多态性、毒力作用及其抑制剂作一综述。

1 牙龈素的分类和结构

牙龈素(gingipains)是存在于牙龈卟啉单胞菌外膜、膜泡以及胞外的一组蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白酶;并因其具有梭菌蛋白酶的一些特征而被归属于梭菌蛋白酶家族。牙龈素可分为两个大类:一类为精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(牙龈蛋白酶R，gingipain R，Rgp)，另一类为赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(牙龈蛋白酶K，gingipain K，Kgp);其中Rgp又可分类为RgpA和RgpB。RgpA、RgpB和Kgp的相对分子质量分别为 9.5×104、5×104和1.05×105，并分别由 rgpA、rgpB 和 kgp 3个基因编码。此前认为RgpA和Kgpa的结构均包括催化结构域和黏附结构域，而RgpB仅有催化结构域;但近来研究发现，RgpB除含有催化结构域外，还含有1个免疫球蛋白超家族域(immunoglobulin superfamily domain)和1个205个碱基的N-末端结构域［3］。目前已证实，位于rgpA和kgp C-末端区域的血凝集素基因hagA可以编码血凝集素等产物，而这些产物对牙龈卟啉单胞菌降解血红蛋白、摄取血红素均有重要的作用［4］。

2 牙龈素的基因多态性

2.1 kgp基因多态性

kgp基因多态性的研究主要根据其C-末端区域或催化域的多态性进行分类。Nadkarni等［5］在对34名牙周炎患者的龈下菌斑进行研究时发现，kgp的C-末端结构域存在基因多态性，并可分为4种类型，分别为:Hg66型、381型、W83型，W83v型，各型比率为 8∶11∶6∶5;其中W83型与 W83v型基因有65%相似性、两者均通过合成一种多肽而抑制血凝反应。作者认为，kgp对毒力的影响主要表现为各基因型产生的血凝素活力不同。Beikler等［6］在对102名牙周炎患者的龈下菌斑进行研究时发现，kgp的催化结构域中也有基因多态性，将聚合酶链式反应得到的长度为890 bp的催化域片段进行MseI酶切后，可根据酶切片段长度不同将kgp催化域分为Ⅰ型(3个片段，长度分别为447、288、135 bp)和Ⅱ型(1 个片段，长度为890 bp);但是并未发现该分型与临床症状有明显的相关性。Li等［7］将上述催化域片段用EcoRⅠ酶切后，又将kgp催化域分为4型，但仍然未发现任何一种类型与临床症状显著相关。

2.2 rgpB基因多态性

rgpB的催化域可因碱基替换产生遗传多态性，因此rgpB基因多态性研究主要根据其催化域的多态性进行分类。Beikler等［8］通过PCR方法得到2210 bp长度的rgpB的催化域片段，经基因测序后将rgpB基因分为5种类型，分别为“NYPN”NSSN、NSSK、NYPK、DYPN 型。李琛等［9］通过酶切分析法将rgpB分为4型(Ñ、Ò、Ó、Õ型)，并证明了不同基因型的rgpB对牙龈卟啉单胞菌的毒力均有影响。

2.3 rgpA基因多态性

rgpA在牙龈卟啉单胞菌的野生株中具有较高的保守性，只在催化域上有细微差异。Allaker等［10］在研究中发现，rgpA可分为3种类型，分别为:A、B、C型;经分析后发现不同类型rgpA的致病性虽有所不同，但差异并不明显。

3 牙龈素对牙龈卟啉单胞菌毒力的影响

多年来的研究已证明牙龈素是牙龈卟啉单胞菌重要的毒力因子之一，其不仅在介导细菌与宿主的相互作用中起着重要的作用，同时还影响牙龈卟啉单胞菌的毒力［11］。在各类牙龈素中，rgpB是一种加工酶，参与牙龈卟啉单胞菌外膜致病因子的处理，从而有助于牙龈卟啉单胞菌在口腔内的定植［12］。Guentsch 等［13］报道，牙周炎患者牙周袋中的rgpB浓度可超过1 μmol/L，并认为rgpB与牙周病的发病有一定相关性。

kgp可通过与血红蛋白结合而使血红蛋白降解，并同时凝集血红素，从而参与牙龈卟啉单胞菌的定植;影响牙龈卟啉单胞菌的生长及其毒力。Haraguchi等［14］发现，kgp对于伴放线聚集杆菌生物膜的脱落和减少有非常重要的作用，并可通过增强牙龈卟啉单胞菌与伴放线聚集杆菌的竞争优势而对牙齿表面菌斑的成熟起到一定作用。虽然kgp参与生产的是一种结构尚未明确的酶，但从以上结果可见，该酶可以对伴放线聚集杆菌的聚集产生破坏，并与牙龈卟啉单胞菌的竞争优势相关。

rgpA和kgp均参与牙龈卟啉单胞菌对口腔上皮细胞的黏附过程，并同时与其他细菌有聚合作用［15］。Guo等［16］在动物模型研究中发现，kgp 和rgpA对种植体周围炎的发生均起到了非常重要的作用。Pathirana等［17］在对牙周炎模型小鼠的颌骨缺失情况、颌骨细菌量情况、血清抗体反应以及各实验菌株外膜的免疫敏感性进行测定后发现，各类型牙龈素对牙龈卟啉单胞菌毒力的影响程度为:kgp＞rgpB＞ ＞rgpA。

4 牙龈素抑制剂的研究进展

有研究发现，KYT-1和KYT-36分别为Rgp和kgp的专性抑制剂，两者的结构分别为:(Cbz)-Lys-Arg-CO-Lys-N(NH3)2和Cbz-Glu［NHN(CH3)Ph］Lys-CO-NHCH2Ph。Kataoka等［18］在KYT-1和KYT-36的基础上，通过药物结构设计得到了 KYT-41，经实验发现 KYT-41对Rgp和kgp均有良好的抑制力和选择性，均可通过破坏牙龈卟啉单胞菌的生理功能而产生强大的抑菌作用;在动物实验中也验证了KYT-41的治疗牙周疾病的能力;尤其对狗的牙周探诊深度更表现出了较好的治疗效果和安全性。作者认为，这种双重抑制剂不仅在治疗牙周病过程中表现出显著的抗炎活性，同时还可起到预防牙周病和治疗早期牙周病的作用。Taiyoji等［19］研究发现，一种来自大米的十二肽CL(14-25)也是一种混合抑制剂，不仅对牙龈卟啉单胞菌有抗菌作用，同时还对Rgp有抑制作用，其抑制参数Ki和Ki＇分别为1.4×10-6mol/L和 4.3×10-6mol/L。进一步研究发现，CL(14-25)的第15位精氨酸残基对Rgp有强力的抑制作用，而第14位的精氨酸残基则在CL(14-25)对Rgp的抑制过程中发挥介导作用，他们最终合成了一种新的专性Rgp抑制剂CL(K25A)，并对Rgp有良好的抑制作用;其抑制参数Ki和Ki＇分别为9.6 ×10-6mol/L 和1.9 ×10-6mol/L［20-22］。另有研究还发现牛乳铁蛋白也可抑制kgp和Rgp，其虽然对浮游态牙龈卟啉单胞菌的生长仅有微弱的抑制作用，但却能明显抑制牙龈卟啉单胞菌的生物膜形成［23-24］。

5 小结

牙龈卟啉单胞菌是口腔常见疾病的主要致病菌之一，牙龈素是其主要的毒力因子。随着牙龈素结构和基因研究的进展，牙龈素对牙龈卟啉单胞菌毒力的影响将更为明确。相信随着牙龈素抑制剂的发展，对牙龈卟啉单胞菌毒力的调控亦将愈加有效。

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