FGFR2异构体及相关剪接因子在人胚胎干细胞和成体干细胞中的表达

傅 歆，谷聪敏，严 笠，肖 苒

（中国医学科学院整形外科医院研究中心，北京 100144）

根据发育的不同阶段，干细胞可以分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs）两大类。体外悬浮培养的人ESCs可模拟体内早期胚胎发育过程，分化形成含有三胚层来源细胞的拟胚体（embryoid Bodies，EBs）。中胚层来源的骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）以及外胚层来源的毛囊干细胞（hair follicle stem cells，HFSCs）均属于 ASCs。来源于不同发育阶段和不同组织器官的干细胞在基因表达调控、表观遗传状态、体外增殖和分化潜能等方面都存在很大的差异［1］。成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）有两个异构体Ⅲb和Ⅲc，它们在生物体个体发育过程发挥重要的调控作用。FGFR2Ⅲb与皮肤的发育有关，其缺失对小鼠具有致死性［2］;FGFR2Ⅲc的缺失会引起骨骼发育异常［3］。现阶段，FGFR2异构体在胚胎发育不同阶段的干细胞中的表达水平尚不明确。本实验比较了人H9 ESCs及其分化的EBs，以及BMSCs、ADSCs和HFSCs中FGFR2异构体及其相关选择性剪接因子的表达。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和细胞

高糖DMEM、PBS和双抗（HyClone公司）;H9 ESC和HFSC细胞培养相关试剂（Gibco和StemCell公司）;Matrigel（BD公司）;如无特殊说明，化学药品（Sigma公司）;引物合成（北京赛百盛公司）;RTPCR和Real-time PCR试剂（Invitrogen和Roche公司）;一抗 OCT4（sc-8629）、CK15（sc-56520）、P63（sc-25268）、CD29（sc-13590）（Santa Cruz公司）;一抗 SSEA-4（560073）、Tra-1-60（560071）、StemflowTM人MSC分析试剂盒（BD公司）;二抗（A21203和A11001）（Invitrogen公司）。

H9 ESC（WiCell公司）（同意书编号:11-W0039）。ADSC来源于接受抽脂术的健康人（青年女性）脂肪组织。BMSC来源于健康志愿者（青年男性）髂骨骨髓。HFSC来源于美容除皱术切下的正常人带毛发头皮（均知情同意）。

1.2 H9 ESC的培养和EB分化

H9 ESC在Matrigel上的培养及EB分化方法见参考文献［4］。

1.3 免疫荧光染色

细胞经甲醛固定后破膜液（0.2%Tween-20/PBS）37℃处理15 min，一抗4℃过夜，二抗室温避光3 h，Dapi染细胞核1 min，荧光显微镜采集图像。

1.4 流式细胞鉴定BMSC和ADSC表面标志物

取第3代BMSC和ADSC，按StemflowTM试剂盒说明书标记表面标志物。样本用FACSAriaTMⅡ流式细胞仪检测蛋白表达。

1.5 RT-PCR检测

Trizol裂解细胞提取总RNA，取1 μg总RNA用于RT-PCR和Real-time PCR检测。引物序列见表1。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 干细胞培养及其生物学特性鉴定

在Matrigel上，H9 ESCs细胞克隆边界光滑，结构致密（图1A）;高表达 OCT4、SSEA-4和 Tra-1-60（图1B，C，D）。H9 ESC悬浮培养后可形成EBs（图1E，F）。EB分化过程中 ESC标志物（OCT4，Nanog）mRNA表达逐渐较低，三胚层标志物（NeuroD1、Brachyury、AFP）表达逐步升高（图1G）。

BMSCs和ADSCs呈梭形平铺生长（图2A），表达CD90、CD73、CD105;不表达造血干细胞标志物CD34、CD116、CD19、CD45 和 HLA-DR（Neg Cocktail）（图2B）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

图1 H9 ESCs和EBs的生物学特性检测Fig 1 Characterizations of H9 ESCs and EBs

图2 BMSC、ADSC和HFSC的生物学特性检测Fig 2 Characterizations of BMSC，ADSC and HFSC（±s，n=3）

HFSCs呈多角形铺路石状（图2C），表达CK15、CD29和P63（图2D）。上皮细胞标志基因E-cadherin在HFSCs中的表达水平显著高于在BMSC和ADSC中（P＜0.001），而间质细胞标志基因N-cadherin、twist和vimentin在 BMSCs和ADSCs中的表达水平显著高于在HFSCs中（P＜0.001）（图2E）。

2.2 FGFR2异构体及相关剪接因子在H9 ESCs和EBs中的表达

FGFR2选择性剪接在H9 ESCs及EBs中均以Ⅲc为主。H9 ESCs向EB分化后，Ⅲb和Ⅲc的表达水平及Ⅲb/Ⅲc的比值均显著升高（P＜0.05）（图3A）。抑制Ⅲb表达的HnRNPA1在EB分化第14天显著上升，而抑制Ⅲc表达的FOX2在EB分化第7天后即显著上升（P＜0.05）（图3B，3C，3D）。

2.3 FGFR2异构体及相关剪接因子在不同组织来源ASCs中的表达

FGFR2异构体在BMSCs、ADSCs和HFSCs中的表达均以Ⅲc为主，但均显著低于H9 ESCs（P＜0.05）;在ASCs中的表达水平由高至低依次为HFSCs、BMSCs和 ADSCs（P ＜0.05）（图 4A）。HFSCs中FGFR2相关剪接因子的表达与H9 ESCs类似，并高于 BMSCs和 ADSCs（图 4B，4C，4D）。

3 讨论

了解不同发育阶段和组织来源的干细胞中FGFR2异构体及其选择性剪接因子的表达，有利于探索FGFR2及其相关信号通路在胚胎发育过程中发挥的功能和机制，为与之相关疾病的诊疗提供理论基础。

图3 FGFR2异构体及其剪接因子在H9 ESCs和EBs中的表达Fig 3 Expression of FGFR2 isoforms and relevant splicing factors in H9 ESCs and EBs（±s，n=3）

本研究发现，H9 ESC向EB分化过程中，FGFR2Ⅲb和Ⅲc的表达水平均显著升高，且Ⅲb/Ⅲc比值升高;提示在胚胎发育早期，FGFR2表达水平升高，且FGFR2选择性剪接方式发生改变。EB分化过程中FOX2在第7天显著提高而HnRNPA1在EB分化的第14天才升高，这可能是EB分化早期Ⅲb/Ⅲc比值升高的原因。

与H9 ESCs一致，FGFR2异构体在3种ASCs的剪接方式均以Ⅲc为主，且在H9 ESCs与HFSCs中的表达水平显著高于在间充质干细胞中。已有研究显示FGFR2Ⅲc与FGF1、FGF2、FGF4和FGF8的亲和力较高［5-6］。FGF2是ESC体外培养中至关重要的生长因子，对维持ESC的自我更新和未分化状态起着至关重要的作用［7-8］。因此，H9 ESCs中高表达FGFR2Ⅲc与其生物学特性在体外的维持有关。此外，ADSC中 FGFR2表达水平显著低于BMSC中，提示FGFR2异构体在不同组织来源的间充质干细胞中的表达水平存在差异，这可能与不同组织来源的间充质干细胞的生物学特性有关。

同FGFR2表达结果一致，H9 ESCs和HFSC中多种FGFR2相关剪接因子的表达水平显著高于间充质干细胞中。H9 ESC高表达多种FGFR2剪接因子可能与其具有的三胚层分化潜能有关。有研究显示，HFSC除了参与毛发周期性的自我更新和生长，在皮肤创伤愈合过程中，HFSC还可增殖并迁移到创伤部位形成新的表皮细胞促进伤口愈合［9］。因此，HFSC高表达多种FGFR2剪接因子可能与其周期性自我更新与迁移能力有关，需进一步研究。

图4 FGFR2异构体及相关剪接因子在ASCs中的表达Fig 4 Expression of FGFR2 isoforms and the relevant splicing factors in ASCs（±s，n=3）

［1］金颖.多能干细胞研究进展［J］.中国细胞生物学学报，2009，31:597-601.

［2］Petiot A，Conti FJ，Grose R，et al.A crucial role for Fgfr2-Ⅲb signalling in epidermal development and hair follicle patterning［J］.2003，130:5493-5501.

［3］ Eswarakumar VP，Monsonego-Ornan E，Pines M，et al.TheⅢc alternative of fgfr2 is a positive regulator of bone formation ［J］.Development，2000，129:3783-3793.

［4］Fu X，Toh WS，Liu H，et al.Autologous feeder cells from embryoid body outgrowth support the long-term growth of human embryonic stem cells more effectively than those from direct differentiation ［J］.Tissue Eng，2010，16:719-733.

［5］Dell KR，Williams LT.A novel form of fibroblast growth factor receptor 2 Alternative splicing of the third immunoglobulin-like domain confers ligand binding specificity［J］.J Biol Chem，1992，26:21225-21229.

［6］ Jognson LB.Physiology of the gastrointestinal tract.4th［M］//MA:Elsevier Academic Press，2006:216-217.

［7］Levenstein ME，Ludwig TE，Xu RH，et al.Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal［J］.Stem Cells，2006，24:568-574.

［8］Amit M，Carpenter MK，Inokuma MS，et al.Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture［J］.Dev Biol，2000，227:271-278.

［9］ Taylor G，Lehrer MS，Jensen PJ，et al.Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis［J］.Cell，2000，102:541-561.