广东和江西省柑橘溃疡病菌的遗传多样性分析

魏楚丹，丁 钿，叶 淦，刘琼光

(1华南农业大学资源环境学院，广东广州 510642;2江西省赣州市果业局，江西赣州 341000)

柑橘溃疡病(Citrus canker)是由柑橘黄单胞柑橘亚种Xanthomonas citri subsp.citri(Xcci)引起的细菌性病害，对柑橘生产造成毁灭性的危害，世界上许多国家将其列为重要检疫性病害［1-2］.该病最早发现于1912年，目前在亚洲、非洲及南美洲等30多个国家均有分布，危害面积占世界柑橘生产面积的1/3，其中亚洲地区发生最为普遍.柑橘溃疡病在我国广东、广西、海南、福建、浙江、江西、湖南、湖北、云南及四川等地为害较重，造成柑橘落叶、枯梢、树势弱，严重时引起落果，影响柑橘的产量和果品的质量［3-6］.

20世纪90年代初，根据柑橘溃疡病菌的地理分布和不同柑橘品种的相对致病性不同，柑橘溃疡病菌被分为5个菌系:A、B、C、D和E菌系，其中A菌系的侵染力最强、毒力较强、分布较广［7］.我国南方柑橘产区溃疡病菌菌系基本都属于A型，但部分地区的研究发现其存在生理生化差异和致病力分化［8］.Vauterin 等［9］根据柑橘溃疡病菌的致病性和寄主专化性将其分成3个致病型，分别为Xanthomonas axonopodis pv.citri致病型Ⅰ，即 A菌系;Xanthomonas axonopodis pv.aurantifolia致病型Ⅱ，即B、C、D菌系和Xanthomonas axonopodis pv.citrumelo致病型Ⅲ，即E菌系.2006年，Schaad等［10］将这3个致病型重新命名，分别为 X.citri subsp.citri、X.fuscans subsp.aurantifolii和X.alfalfae subsp.citrumeo.2000年在美国佛罗里达州发现另一新菌系，被暂定名为Aw 菌系［11］.

目前，国内外关于柑橘溃疡病菌的遗传多样性分析已有相关研究和报道.Swings等［12］采用 AFLP指纹识别技术，对来自伊朗和韩国的43个柑橘溃疡病菌进行研究，发现供试菌株可分为6个遗传组.姚廷山等［13］采用引物 BOXA1R的 REP-PCR技术，对来自我国9省(区)共18个柑橘溃疡病菌株进行了遗传多样性分析，取遗传相似距离为0.5时，供试菌株可划分为4个簇，其中有15个菌株与标准A菌株的遗传相似距离较近;来自同一省份的少数溃疡病菌株的遗传相似性也较低.由于研究者所收集的溃疡病菌株数量、标本采集的时间、柑橘品种及地理来源的差异，还有研究方法的不同，导致研究结果的差异.此外，在长期的柑橘生产过程中，由于柑橘品种的更换和环境的改变，病菌也会产生变异，由此，笔者认为柑橘溃疡病病菌菌系多样性的研究需要不断深入和完善.

研究发现REP(Repetitive extragenic palindromic)和ERIC(Enterobacterial repetitive intergenic consensus)序列在微生物中广泛存在，随机分布且在进化中呈高度保守状态.以REP、ERIC等序列为引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到不同带型，从而形成了被测菌基因组特异的指纹图谱的技术为REP-PCR DNA指纹技术.该技术方法简单、快速、敏感和分辨率高，现普遍应用于流行病学中的致病菌株鉴定和确定细菌间的亲缘关系.

本研究利用ERIC-PCR的方法对主要来自广东和江西两省的12个市(县)的12个柑橘品种71个柑橘溃疡病菌株进行了遗传多样性分析.这将有助于揭示广东和江西两省柑橘溃疡病菌菌株的本质差异，为生产中柑橘溃疡病菌的流行监测，品种合理布局和溃疡病防治等提供重要参考.

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

来自江西和广东不同县市的柑橘种植区的柑橘溃疡病病叶或病果.柑橘溃疡病细菌的分离采用LB培养基，其配方为:牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸镁0.25 g，磷酸氢二钾2 g，磷酸二氢钾0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水 1 L.Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、dNTPs、Loading Buffer 和细菌基因组DNA提取试剂盒均购于北京全式金生物技术有限公司.

1.2 柑橘溃疡病细菌的分离纯化和鉴定

1.2.1 标本采集和细菌分离纯化 2011—2012年先后从江西和广东不同县市的柑橘种植区采集溃疡病病叶或病果.病原细菌的分离采用平板划线法，挑取Xcci的特征性单菌落，纯化、PCR鉴定.

1.2.2 Xcci病菌的检测和鉴定 将分离纯化得到的细菌，用柑橘溃疡病细菌特异性引物［14］JYF5(5'-TTCGGCGTCAACAAAATG-3')和JYR5(5'-AACTCCAGCACATACGGGTC-3')进行PCR检测和鉴定.25 μL的PCR反应体系:模板(10～50 ng)1μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)2.0 μL，引物JYF5(10 μmol·L-1)和 JYR5(10 μmol·L-1)各 1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，补充 ddH2O 至 25 μL.PCR反应条件:94℃ 3 min;94℃ 30 s，54℃ 30 s，72 ℃ 45 s，32 个循环，72 ℃延伸 7 min，PCR 产物4℃保存.PCR产物在10 g·L-1琼脂糖凝胶上电泳检测.

1.3 Xcci病菌的REP-PCR分析

1.3.1 Xcci总DNA的提取 将供试的71个Xcci菌株接种在LB(液体)培养基中，30℃、180 r· min-1振荡培养12 h.用DNA提取试剂盒，提取病原细菌基因组总DNA，并将DNA质量浓度调至50 ng·μL-1，在10 g·L-1的琼脂糖凝胶上电泳检测.

1.3.2 REP-PCR扩增 采用以细菌基因组内广泛存在的短重复序列ERIC为基础设计的引物ERIC1R(5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3')［15］与 ERIC2(5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')［16］，PCR 反应体系为25μL:模板(Xcci总DNA)1μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 μmol·L-1)2.0 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.4 μL，补充ddH2O至25μL.反应条件:95℃ 7 min;94℃ 1 min，52℃ 1 min，65℃ 8 min，32个循环，65℃ 15 min，PCR产物4℃保存.取6～8μL扩增产物于15 g·L-1琼脂糖胶上电泳(电压为6 V·cm-1，时间2～3 h).

1.3.3 REP-PCR图谱的聚类分析 利用ERIC引物扩增产物电泳图谱中各位点条带的有无对REP-PCR扩增产物的指纹图谱进行读带，有带的记为“1”，无带的记为“0”，制成Excel文件用于聚类分析.

利用NTSYS软件，对结果以非加权算术平均数配对法(Unweighted pair-group method with arithmetic averages，UPGMA)绘出聚类树状图，构建系统树状图谱，并进行菌株的聚类分析.

2 结果与分析

2.1 柑橘溃疡病菌菌株的分离

通过标本采集、病原细菌分离、纯化后得到的单菌落，经过Xcci特异引物JYF5/JYR5的PCR扩增，得到大小为413 bp的特异性目标条带，确定都是Xcci.本研究共获得了来自江西和广东两省12个市(县)12个柑橘品种的71个溃疡病细菌菌株(表1).

表1 柑橘溃疡病菌菌株编号、地理来源和柑橘品种Tab.1 The number，geographical origin and citrus variety of Xanthomonas citri subsp.citri

2.2 柑橘溃疡病菌REP-PCR

采用试剂盒提取病原菌Xcci基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳条带清晰，可用于REP-PCR分析.以Xcci细菌基因组DNA为模板，用 ERIC1R与ERIC2引物进行ERIC-PCR反应，结果发现:引物ERIC扩增的片段大小主要在750 bp以上，有5～12条指纹主带，共10种指纹谱型(图1).所有菌株之间的相似性高，相似度达0.55，部分菌株差别较少，如 Xcci 1与 Xcci 2等;Xcci 62和 Xcci 63等菌株与其他菌株差异较大.来自不同地区的同一柑橘品种的溃疡病菌株的指纹图谱通常差异性较小，如Xcci15与Xcci20菌株，但也存在差异较大的情况，如Xcci 6与Xcci 40菌株.来自同一地区的不同柑橘品种分离得到的溃疡病菌株，指纹图谱存在部分差异，如Xcci10与Xcci 12菌株，有些差异不明显，如Xcci11与Xcci 48菌株.来自不同地点不同柑橘品种上的溃疡病菌株间差异相对明显，如Xcci1与Xcci71等菌株.

图1 不同地理来源的71个Xanthomonas citri subsp.citri菌株的ERIC-PCR扩增结果Fig.1 The ERIC-PCR electrophoretogram of71 Xanthomonas citri subsp.citri strains from different geographical origins

2.3 Xcci菌株的聚类分析

根据PCR扩增DNA产物指纹带位的有无，转换为数码1或0，采用NTSYS软件对71个柑橘溃疡病菌菌株进行UPGMA聚类分析.结果表明，在相似水平为0.64时，供试的71个菌株大体可以聚为A、B两簇(图2).取相似水平为0.88时，A簇又可分为6个遗传组，其中A1是主要遗传组，在相似水平为0.88时，B簇可分为6个遗传组群(图2).各遗传组所含菌株见表2.

如表2所示，聚类分析结果表明，71个Xcci菌株在相似系数为0.88时，可以分为A、B两簇，A簇可以分为6个遗传组，A1遗传组以4个来自广东深圳的橘红品种和11个来自江西脐橙品种的菌株为主;A2遗传组包括2个来自广东新会的红柠檬菌株;A3遗传组主要包括来自广东顺德的12个朱砂橘的菌株;A4遗传组只有1个来自广东新会的砂糖橘菌株;A5遗传组包括7个广东廉江的红橙菌株;A6遗传组只有1个来自广东廉江的红橙菌株.在相似水平为0.88时，B簇有6个遗传组，B1遗传组有7个来自广东新会的新会橘和新会柑菌株;B2遗传组主要包括3个来自广东梅县沙田柚品种的菌株;B3遗传组有2个来自广东新会的甜橘和红柠檬菌株;B4遗传组是来自广东的6个脐橙品种的菌株;B5遗传组主要包括来自广东阳春4个马水橘品种的菌株和3个砂糖橘菌株;B6是来自广东阳春的2个砂糖橘品种的菌株.

图2 71个Xcci菌株ERIC-PCR的DNA聚类分析树状图Fig.2 DNA dendrogram constructed by ERIC-PCR data of Xcci

表2 71个Xanthomonas citri subsp.citri菌株ERIC-PCR遗传组Tab.2 The ERIC-PCR genetic groups of 71 Xanthomonas citri subsp.citri strains

3 讨论与结论

有关柑橘溃疡病菌菌系的遗传多样性研究，国内报道较少.姚廷山等［13］曾用BOXA1R引物，将来自我国9省(区)的18株柑橘溃疡病菌株分为4～5个簇，其中江西和广东各1个脐橙菌株.本研究选择了包括脐橙、朱砂橘、柠檬和砂糖橘等12个不同品种上的71个菌株，采用ERIC引物扩增，将柑橘溃疡病菌分为2个簇群12个遗传组，进一步丰富了前人的结果.本研究收集的71个菌株54个来自广东、17个来自江西，聚类分析结果表明，71个Xcci菌株可以分为A、B两簇，A、B簇又分别可分为6个遗传组.

进一步分析发现，来自江西省主要柑橘产区的柑橘溃疡病菌株均聚在A簇，而来自广东省的菌株绝大部分聚在B簇，表明柑橘溃疡病菌的遗传组与地理来源有一定的相关性.新会的红柠檬品种和新会橘品种与其他菌株间差异较大.研究还发现，来自江西省的绝大多数脐橙品种的菌株聚在A1遗传组，而朱砂橘品种均分布在A3遗传组，新会橘品种分布在B1遗传组，马水橘品种分布在B5遗传组等，由此表明，柑橘品种与溃疡病细菌的遗传多样性之间具有一定的相关性.

聚类结果发现，柑橘溃疡病细菌在不同的地区及不同时间产生了分化，这是利用传统的形态标记技术很难检测到的，REP-PCR技术具有很高的灵敏度和准确性，能够用于遗传多样性和遗传分化研究.且REP分析所需要的仪器设备相对简单、检测速度快，能够处理大量菌株.随着引物数量的增加，更多数量和更多来源菌株的采集，Xcci菌株的遗传多样性分析将更趋于完善.

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【责任编辑霍 欢】