快中子对食管癌细胞EC9706的生物效应

杜晓红，佟 倜，景士伟，武文斌，孙迎春

（1.内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古 包头014010；2.吉林大学第二医院胸外科，吉林 长春130041；3.东北师范大学物理学院，吉林 长春130024）

中子属于高线性能量传递（Linear Energy Transfer，LET）射线，直接破坏细胞内DNA 分子，同时还破坏细胞其他结构，细胞难于修复，它对细胞杀伤主要是单击致死性损伤.快中子对抵抗普通放疗的乏氧肿瘤细胞也有杀伤作用；其次，快中子相对生物效应比普通X 线作用大3倍，而且对处于分裂周期不同时相的细胞均敏感.超热中子能量为1eV～10keV，多应用于硼中子俘获治疗（BNCT），热中子能量低于1eV，可用于皮肤黑色素瘤等浅部肿瘤治疗.文献报道了大量有关中子辐射生物效应及治疗肿瘤研究［1－6］.现以我中心自制中子源装置，经体外实验初步检测快中子对EC9706的生物效应，为快中子在治疗中的应用及安全性提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株及实验分组

将冻存于液氮中的人源性食管癌细胞株EC97069（购于中国医学科学院肿瘤细胞库）取出后常规方法复苏，培养于含质量分数为10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中，在体积分数为5% CO2的37℃孵箱内培养.用质量分数为0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，离心收集后用无菌PBS缓冲液（pH＝7.4）洗涤2次，镜下计数，调整细胞浓度至5×104个／mL，以每孔2.5和0.2mL 分别接种于96孔和6孔培养板中，96孔板的最外环的孔内分别加入0.2mL PBS缓冲液，以减少细胞生长时的边缘效应.96孔板细胞用于MTT 法检测细胞活性，分为6组（1个培养板设为1组，每组60个复孔）.6孔板细胞用于流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡和坏死，分为5组（1个培养板设为1组，每组6个复孔）.待细胞贴壁且生长稳定后进行快中子照射，照射之后置于37℃恒温、5%CO2孵箱中，继续孵育24h后用于检测.

1.2 快中子产生与照射场地

采用中子管为快中子发射源（东北师范大学物理学院自制）.其中子产额为1×108个／s，中子能量为14 MeV.照射场地在距地面5m 深的具有回廊结构的地下中子实验厅内进行（通过国家辐射实验室标准检测）.被照射样品置于照射场地后，实验人员在地上操控室里调节中子发生控制电路、中子检测仪和γ射线监测仪，控制电路可调节辐照时间和中子产额，中子监测仪和γ射线监测仪可监测每一瞬时中子剂量和γ射线剂量，所有数据通过MCA 收集并存入电脑.照射时将培养板置于中子管发射端口正下方约2cm 处，同时在发生器周围旋转中子监测仪和γ射线监测仪用于监测辐照的中子剂量及产生的γ射线剂量.

1.3 MTT检测细胞活性

从培养箱中取出照射24h 后的96 孔细胞培养板，加入20μL／孔MTT 溶液（质量浓度为5mg／mL），培养箱中再孵育4h后终止，吸弃孔内培养基，再加入150μL／孔DMSO，待紫色结晶物完全溶解后，应用酶标仪在490nm 波长下测定其吸光度（即OD 值）.细胞增殖抑制率＝（1－校正后实验组OD 均值／校正后对照组OD 均值）×100%.

1.4 Hoechst33342／PI双染检测细胞凋亡

取出中子辐照后继续孵育24h的6孔板细胞，室温下用0.25%胰蛋白酶消化，收集各组细胞于EP管中，再置于冰块操作平台（保持4℃左右），以Hoechst33342与PI染色，避光放置15min，染色后1h内用流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）检测其凋亡率与坏死率.Hoechst 33342 的激发波长为352nm，发射波长为400～500nm，产生蓝色荧光；PI的激发波长为488nm，发射波长大于630nm，产生红色荧光.

1.5 统计学分析

应用统计学软件SPSS16.0版进行统计分析，计量数据采用（¯x±s）表示，各实验组细胞凋亡率、坏死率进行单因素方差分析（ANOVA）.P＜0.05表示差异，有统计学意义.

2 结果

2.1 快中子对细胞的抑制呈剂量依赖性

以96孔板最外围孔OD值为标准进行校正后计算细胞抑制率.MTT方法检测结果显示，快中子照射实验组细胞的生长呈抑制效应，细胞存活量减少，OD 值下降（见表1）.与对照组比较，照射的各实验组（3min（0.02Gy）～15 min（0.1Gy））细胞增殖抑制率呈剂量依赖趋势.15 min照射组细胞抑制率为67.4%.

表1 快中子作用后各组细胞OD值（¯x±s）

2.2 肿瘤细胞的坏死呈剂量依赖性

Hoechst33342／PI荧光双染的各组细胞进行流式细胞仪检测计数，P3区间为凋亡细胞计数，P4区间为坏死细胞计数（见图1）.结果表明：细胞凋亡率比较（各治疗组与对照组比较），P＜0.01；治疗组间比较，细胞凋亡率无统计学差异；细胞坏死率比较（治疗组与对照组比较），P＜0.05；15min（0.1Gy），30min（0.2Gy），45 min（0.3 Gy）组间比较，P＞0.05；15 min（0.1 Gy），30 min（0.2 Gy），45 min（0.3Gy）组分别与60min（0.4Gy）组比较，P＜0.01，认为60min组较其他组的细胞坏死率显著增加.结果提示与对照组比较，快中子照射后细胞坏死率增加，并且呈剂量依赖趋势（见表2）.

图1 不同剂量快中子作用后EC9706流式检测直方图

表2 快中子作用后各组EC9706细胞坏死率与凋亡率（¯x±s）

3 讨论

MTT 法与流式细胞仪检测，证实中子束对人源性食管癌细胞EC9706呈增殖抑制作用，在一定的时间－剂量范围内呈正相关.表现为照射时间－剂量增加，肿瘤细胞凋亡与坏死比例增加，其中以坏死为主，不同剂量组之间细胞坏死率存在统计学差异.

中子射线属于高直线能量转换（Linear energy transfer，LET）射线，具有独特的放射生物学特性，如较高的相对生物效应、对细胞周期依赖性小、氧增强比值低、癌细胞受照射后潜在致死性损伤和亚致死性损伤难以修复等.中子杀伤肿瘤的机理可能也是主要通过凋亡途径来实现的.由于中子损伤效应主要由错误修复和难以修复的簇集损伤造成［7］，细胞DNA 损伤修复速率减慢，更多的DNA 损伤被固定，以致细胞存活率下降.本文研究证实快中子对人食管癌细胞株EC9706存在体外呈剂量依赖的抑制作用，并且作用机制以致细胞坏死为主，为快中子体内效应研究及临床应用等提供了一定的理论依据.

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