分子印迹技术在恩诺沙星检测中的应用

汤轶伟，李 译，兰建兴，魏立巧，高子媛，张德福，高 雪，励建荣（渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学食品研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

分子印迹技术在恩诺沙星检测中的应用

汤轶伟，李 译，兰建兴，魏立巧，高子媛，张德福，高 雪，励建荣*
（渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学食品研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

恩诺沙星属喹诺酮类抗生素药物，常被应用在畜禽、水产养殖疾病的防治中，但是长期食用残留有该药物的食品会严重损害人体健康。分子印迹技术以其操作简单、性能优越等特征广泛应用在食品安全检测中。本文综述了国内外分子印迹技术在样品前处理、高效液相色谱及传感器等方面对恩诺沙星检测的最新应用研究进展，分析了该技术的应用前景及需要解决的问题。

恩诺沙星，分子印迹技术，检测方法

恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）属于第三代喹诺酮类抗生素药物，其结构式见图1，具有高效广谱、耐药菌少、与其他抗菌药的耐药交叉性小等特点，被广泛用于畜禽、水产养殖疾病的防治[1]。近年来，由于长期或不规范用药导致食品残留和环境中ENR含量不断增加，严重的危害了生态环境和人类健康[2-3]。

图1 恩诺沙星结构式Fig.1 The structure of enrofloxacin

目前，检测ENR残留的方法主要有微生物法[4]、高效液相色谱法（HPLC）[5]、免疫检测法[6-7]等。微生物法简单快速，但检测限高，特异性差；色谱检测法耗时长、样品前处理复杂且需要昂贵的仪器，难以大规模使用；免疫检测法简单、快速，检出限低，可进行大规模筛选，但是ENR抗体的制备需要大量实验动物，而且抗体在恶劣环境下易于失活，影响检测结果。

分子印迹技术（molecular imprinting technique，MIT）是近年发展起来的制备功能性材料的新方法，利用该技术制备的分子印迹聚合物（MIP）具有理化性质稳定、成本低、可重复利用等特点，已成为检测领域研究的热点，也为样品中ENR的提取和检测提供了新选择。本文综述分子印迹技术在样品前处理、HPLC、传感器、仿生荧光免疫分析等方面的最新研究进展，为提高我国的ENR残留检测能力提供技术保障。

1 分子印迹技术

分子印迹技术以Ficher提出的酶-底物相互作用的“锁-钥匙”模型为理论基础，以该技术制备的功能性材料称为分子印迹聚合物（molecular imprinted polymers，MIPs）。MIPs制备过程：首先，将功能单体和模板分子溶解在某种溶剂中形成类似酶与底物结合物的契合物；然后加入交联剂，在引发剂的作用下使形成的契合物与交联剂发生自由基共聚合形成高分子聚合物；最后用适当的方法除去模板分子，得到与底物（模板分子）相匹配的三维立体孔穴结构，这种结构具有类似酶对底物的专一性。

根据聚合过程中模板分子和功能单体之间作用力形式的不同，分为由Wulff等[8]提出的共价键聚合和由Mosbach等[9]提出的非共价键聚合。根据聚合方式的不同又可分为本体聚合、悬浮聚合、沉淀聚合、表面印迹聚合、可控/活性自由基聚合等[10]。

2 分子印迹技术在ENR检测中的应用

2.1 样品前处理

良好的样品前处理技术对复杂样品中痕量、超痕量物质的分析极为重要。传统的样品前处理方法主要有：液液萃取、固液萃取和索氏提取等。这些方法需要使用大量的有机溶剂和样品、处理时间长、操作繁琐、易造成二次污染并且特异性较差。固相萃取（Solid-phase extraction，SPE）技术的出现为样品前处理带来了突破性的发展。然而，传统的固相萃取材料键合硅胶、无机基质材料和混合型固相萃取材料通常特异性不强，在富集分析物的同时，一些干扰物也会一同被富集，干扰仪器分析结果的准确度和检出限[11]。分子印迹聚合物以其高亲和性、高特异性和高稳定性等优点在ENR检测的样品前处理中得到了广泛的研究。

2008年，张毅等[12]以ENR为模板分子，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，采用活性/可控自由基聚合制备了ENR分子印迹微球。实验通过改变AIBN和可逆加成-断裂链转移剂（二硫代苯甲酸异丙苯酯，CDB）的比例控制分子印迹微球粒径和分散性，可使微球的粒径达到2.0～2.2μm，分散性良好；吸附实验显示，该聚合物的最大吸附容量为65.2μmol/g且具有较好的选择性。该实验结果为ENR分子印迹聚合物作为新型SPE吸附材料提供了可能。

Benito-Peña E等[13]以ENR为功能单体，异丁烯酰胺为功能单体，EDMA为交联剂，偶氮二异戊腈为引发剂合成ENR分子印迹聚合物。以该聚合物对河水样品中ENR残留净化富集，回收率可达66%～100%（RSD：2%～12%；n=3）；建立的SPE-HPLC检测方法的检测限0.01μg/L，有效去除了样品提取过程的杂质，降低了检出限。

Yan H Y等[14]以氧氟沙星为模板分子，甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）为功能单体，EDMA为交联剂，AIBN为引发剂，在甲醇/水（10∶1；v∶v）环境下聚合制备分子印迹聚合物。以该聚合物作为SPE萃取材料对牛奶中ENR及其代谢物环丙沙星（CPX）净化富集，平均添加回收率为81.2%～94.8%（RSD＜7.5%，n=5）；HPLC检测结果显示，经该分子印迹聚合物处理的牛奶样品没有杂质干扰，且能有效富集ENR和CPX。

2009年，Benito-Peña E等[15]以文献[13]制备的ENR分子印迹聚合物应用在缓冲溶液及尿样中ENR等药物的样品处理中。实验结果显示两种样品的添加回收率为84%～88%（RSD＜6.0，n=3），以此为样品前处理方法建立的HPLC检测方法的检出限为1.9ng/mL。该MIP-SPE柱前处理方法简单、有效并且能重复使用90次以上，大大降低了样品前处理成本。

Díaz-Alvarez M等[16]第一次比较了阳离子交换柱和CPX分子印迹聚合物对婴儿食品中ENR等喹诺酮及氟喹诺酮类药品残留净化富集效果。实验结果表明，阳离子交换柱能实现对喹诺酮和氟喹诺酮药物的富集、净化，以此为样品前处理过程建立的HPLC检测方法的检出限为0.03～0.11μg/g；以CPX分子印迹聚合物为净化富集材料建立的HPLC检测方法的检出限为0.009～0.0445μg/g，大大优于阳离子交换柱的净化富集效果，但是由于分子印迹聚合的特异性，使该方法只能对氟喹诺酮类药物有效。

2010年，Wang X Y等[17]以ENR为模板分子，MAA为功能单体，EDMA为交联剂制备了ENR分子印迹聚合物。以该聚合物对鸡肉中ENR药物富集、净化处理，结果显示不同ENR添加水平下的回收率为77.84%～86.52%（RSD＜4%，n=6），以此为样品前处理方法建立的高效毛细管电泳检测鸡肉中ENR方法的检出限92.02μg/kg。实验结果表明，该方法适合鸡肉中ENR残留的测定。

Sun X L等[18]以诺氟沙星（NOR）为模板分子，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，添加室温离子液为致孔剂，采用原位分子印迹技术直接在不锈钢柱（100mm×4.6mm，id）中制备了NOR分子印迹整体柱。以该整体柱直接与HPLC泵相连，对猪肉中NOR、ENR等8种药物进行净化、富集。实验结果显示，该分子印迹整体柱对这8种药物的回收率为78.16%～ 93.50%，所建立的HPLC检测方法对ENR的检出限为1.15μg/L，该方法为猪肉中NOR、ENR等药物残留的检测奠定了基础。

Qiao F X等[19]以氧氟沙星为模板分子、甲醇/水为聚合溶剂制备的分子印迹聚合物为分散固相萃取材料对鸡肉中ENR和环丙沙星药物进行提取、净化和富集处理。实验结果显示，最优条件下该方法对鸡肉中ENR的添加回收率为82.7%～96.6%（RSD＜5%，n=5），以该方法为样品前处理方法建立的HPLC检测方法的线性范围为0.03～200μg/g。该方法操作简单，有机溶剂需要量少，能满足鸡肉样品前处理的要求。

Zheng M M等[20]以培氟沙星为模板分子，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，AIBN为引发剂，直接在直径为530μm毛细管中制备分子印迹聚合物。以该毛细管分子印迹整体柱对牛奶样品中的ENR等6种药物进行提取、净化和富集，结果显示对ENR的添加回收率为94.5%～96.5%，建立的HPLC检测方法的检出限为0.8ng/mL。

超过95%的学生认为该教学方法可以提高学习的积极性和主动性，加深对护理程序的理解和应用，同时也增强沟通交流能力。学生赞同能培养人文关怀素养、增强团队协作能力、培养临床实践能力、培养临床思维能力、使知识掌握更牢固的比例分别为：91.5%、90.3%、93.4%、92.6%、94.1%（见表1）。

Chen L G等[21]以环丙沙星为模板分子，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，Fe3O4为磁性基质，制备了磁性分子印迹聚合物。以该聚合物对水样中ENR等氟喹诺酮类药物进行提取、净化和富集，实验结果显示该磁性印迹聚合物对喹诺酮类药物的添加回收率为76.3%～94.2%，能有效去除水样中杂质对检测过程的影响，建立的LC/MS检测方法的线性范围为20～ 2000ng/L，该方法在对湖水、河水、污水等实际样品的应用中表现出良好的性能。

2011年，Qiao F X等[22]以氧氟沙星和茶碱为模板分子，MAA为功能单体制备分子印迹聚合物。以该聚合物为固相分散材料对血液中氧氟沙星、ENR、环丙沙星、茶碱、咖啡因等药物进行提取、净化、富集，实验结果显示：最优条件下对血样的添加回收率为89.5%～104.0%（RSD＜5.0%，n=3），所建立的HPLC检测方法对ENR的检出限为0.08μg/g。该方法以两种分子为模板制备分子印迹聚合物，增加了MIP对目标物的特异富集范围，提高了提取、富集效率。

2012年，Blasco C等[23]以商品化的喹诺酮分子印迹聚合物SPE对蛋中环丙沙星、ENR、氧氟沙星等11种喹诺酮药物进行提取、净化和富集。实验结果显示，对样品的添加回收率为90%～106%（RSD＜8%，n=3），建立的LC-MS/MS方法的检出限为0.12～ 0.85ng/g，测定限为0.36～2.59ng/g。

2013年，Luaces M D等[24]以依诺沙星为模板分子，MAA和三氟甲基丙烯酸为功能单体，EDMA为功能单体，偶氮二异戊腈为引发剂制备分子印迹聚合物。以该聚合物为SPE吸附材料对水样中ENR药物进行提取、净化和富集。实验结果显示，最优条件下对不同浓度矿泉水、自来水、河水样品中ENR的添加回收率为84%～119%（RSD＜7.6%，n=3）；在以该样品处理方法为基础建立的3（1，10-邻二氮菲）-钌（II）/过硫酸铵系统（MISPE-FI-CL）化学发光检测分析中对ENR的最低检出限为0.27μg/L。

分子印迹聚合物具有的独特选择性和亲和力与SPE的高效萃取率相结合，提高了样品前处理效率和ENR的提取率，能克服样品体系复杂（污水、畜禽产品等）、预处理繁杂等不利因素，提高分析仪器的检测能力，也为不同样品前处理的标准化奠定基础。

2.2 在HPLC中的应用

HPLC既能对待测物进行分离，又能对待测物定量分析，关键是选择合适的色谱柱。目前，该方法多以高纯硅胶键合的C18、C8、苯基柱为分离柱，以有机溶剂-酸性溶液-离子对试剂为流动相[25]。但是，使用HPLC方法对食品中ENR残留进行检测分析之前都需要采用一定方法对样品提取物进行净化、富集，以提高检测的精确度和检出限。

2008年，Liu H N等[26]以ENR为模板分子，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，AIBN为引发剂，采用可逆加成-断裂链转移聚合技术直接在不锈钢色谱柱（150mm×4.6mm，id）中合成ENR分子印迹聚合物。实验优化了引发剂、功能单体的量对整体柱中分子印迹聚合物粒径与孔穴的影响，通过以该整体柱作为HPLC的分离柱对ENR和洛美沙星进行实际分离，研究了整体柱分子印迹聚合物结构与分离效果的关系，为分子印迹整体柱在HPLC对ENR的检测奠定了基础。直接在色谱柱中合成ENR分子印迹聚合物具有制备简单，操作方便等优点，但是该方法模板分子不易洗脱，应用过程中会有目标物泄露现象。

2011年，Rodríguez E等[27]以ENR为模板分子，采用沉淀聚合方法制备ENR分子印迹聚合物微球。以此分子印迹聚合物为固相萃取材料在线联接HPLC检测水样中痕量ENR等6种喹诺酮类药物，ENR分子印迹聚合物在色谱柱的一端对喹诺酮类药物进行净化富集，实验结果显示最优条件下该方法的回收率为62%～102%（RSD＜6%，n=3），检出限为1～11ng/L。该方法为在线净化、富集处理水样中ENR残留，提高检测效率奠定了基础。

2.3 在传感器中的应用

传感器由识别元件和信号转换器组成，分子印迹聚合物常以膜或微球的形式结合在识别元件表面，当MIP与印迹分子结合后能产生与待测物成定量关系的信号，通过检测输出信号来实时定量分析待测物含量，可分为光传感器、化学传感器、质量传感器等。分子印迹传感器具有较高的灵敏度、较好的选择性和较低的价格等优点，受到科研工作者的广泛关注。目前，ENR分子印迹传感器的研究主要为光学传感器，这种传感器造价低廉，容易操作，应用前景广阔。分子印迹聚合物膜衍射光栅制备过程见图2。

2011年，Barrios C A等[28]以ENR为模板分子，MAA和甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）为功能单体，EDMA为交联剂，ABDV为引发剂，以SiO2/Si为基础采用转移微模塑法制备微图案化ENR分子印迹聚合物膜衍射光栅。实验结果显示，以该衍射光栅为基础建立仿生光衍射传感器的衍射效率与目标分子ENR的浓度呈正相关，最优条件下该方法的检出限为18μmol/L。ENR分子印迹光衍射传感器检测方法具有快速、成本低、特异性好等优点，为该类型传感器的深入研究及商品化奠定了基础。

图2 分子印迹聚合物膜衍射光栅制备过程[28]Fig.2 Representation of the molecular imprinting polymers diffraction grating

2012年，Xuan-Anh T等[29]以ENR为模板分子，MAA为功能单体，HEMA为功能单体，EDMA为交联剂合成分子印迹聚合物。以该聚合物为固定小分子基质材料建立了荧光偏振（fluorescence polarization）传感器检测自来水、牛奶中ENR残留的快速检测方法。实验结果显示，最优条件下水样品的最低检出限为36ng/L，牛奶为0.28μmol/L。该方法简单、快速，能直接通过结合在分子印迹聚合物上的ENR的荧光偏振强度对溶液中的待测物定量分析。

2013年，Zdunek J等[30]建立了以分子印迹纳米丝为基础的光学传感器检测ENR抗生素的方法。纳米丝传感器以多孔氧化铝为纳米模制备的共价型ENR表面分子印迹聚合物，检测时首先将传感器在含有ENR的乙腈/HEPES缓冲液（100mmol/L，pH7.5，50∶50，v∶v）中孵育20min，然后在10mmol/L Eu3+溶液中孵育一段时间使结合在分子印迹聚合物表面的ENR与Eu3+形成络合物，通过检测稀土元素Eu3+-ENR络合物发出的荧光强度（λexc=340nm；λem=612nm）测定溶液中待测物ENR的含量。实验结果显示，最优条件下该方法的线性范围为0.53～5μmol/L。该方法具有发射波长长、发射普带窄等特点，适合传感器的应用。

2.4 其他方面的应用

2013年，Descalzo A B等[31]建立了核-壳型分子印迹聚合物福斯特能量转移（Forster resonance energy transfer，FRET）荧光检测ENR含量的检测方法。福斯特能量转移示意图见图3。该方法将Ru（phen）32+发射供体埋入纳米硅球中后为核，然后在硅球外合成厚约7nm的ENR分子印迹聚合物壳，受体为ENR-花青素偶联物。实验优化了Ru（phen）32+硅球核及分子印迹聚合物壳的合成条件，建立了仿生竞争荧光检测方法。实验结果显示，该方法的最低检测限为2μmol/L。该方法具有快速、简单、无背景吸收等特点，有望成为荧光免疫分析的替代方法。

图3 福斯特能量转移示意图[31]Fig.3 Forster resonance energy transfer

3 结论与展望

传统的仪器法和免疫检测法是ENR残留检测和筛查的常用方法。然而，仪器法通常需要昂贵的实验仪器和复杂的样品前处理程序，不适合现场快速检测的需要；免疫分析法也易受环境条件影响产生假阳性结果。所以，以分子印迹技术制备的分子印迹聚合物以其优良的理化性质、简单的制备方法迅速成为检测领域研究的热点。

ENR分子印迹聚合物的研究已制备出可重复使用、理化性质稳定的新型样品前处理材料，为建立统一的样品前处理技术奠定基础；分子印迹整体柱的制备为色谱柱固定性材料的的选择提供了新方法；分子印迹生物传感器的研究也为实时、在线检测样品中ENR提供可能；仿生荧光免疫分析的探索为寻找生物抗体替代品提供了思路。但是，ENR分子印迹聚合物的研究还有待进一步深入：a.目标分子与分子印迹聚合物之间的分子识别机理还仅限于分子之间的相互作用力的研究（如氢键、疏水作用力等），更深入的分子识别机理研究还有待研究；b.分子印迹聚合物结合位点与传质机理认识尚浅；c.提高ENR仿生免疫分析方法的特异性、灵敏度和重现性是该方法能否代替传统免疫分析的关键，可以通过改进制备ENR分子印迹聚合物的方法，提高分子印迹聚合物水相分子识别能力加以改善。

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Research progress in application of molecular imprinted technique in determination of enrofloxacin

TANG Yi-wei，LI Yi，LAN Jian-xing，WEI Li-qiao，GAO Zi-yuan，ZHANG De-fu，GAO Xue，LI Jian-rong*
（Food Science Research Institute of Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

Enrofloxacin（ENR）is a kind of fluoroquinolones which is usually used in the livestock，poultry，and aquatic production to prevent and cure diseases.However ENR residues in food are definitely harmful to health.Molecular imprinted technique（MIT）is widely used in food safety detection because of its simple operation and superior performance.In this article，MIT applied in sample pretreatment techniques，HPLC，sensors，etc，to detect ENR was reviewed based on domestic and foreign bibliography，and the application prospect of MIT was also introduced.

enrofloxacin；molecular imprinted technique；detection method

TS201.6

A

1002-0306（2014）12-0368-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.072

2013－10－14 *通讯联系人

汤轶伟（1981-），男，讲师，研究方向：食品安全与检测方法。

国家“十二五”科技支撑计划（2012BAD29B06）；辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”与“辽宁省食品安全重点实验室”开放课题资助项目（LNSAKF2011021）。